Online pH und DO Messungen in Microcarrier-basierten hMSC Kultivierungen

Kulturüberwachung in einem Single-Use Spinner mit integrierten Sensorspots

Spinner-Flaschen werden oft für Mikrocarrier-basierte Kultivierungen von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) verwendet. Normalerweise sind diese nicht mit pH- und gel?sten Sauerstoffsonden ausgestattet. Dieser Applikationsbericht beschreibt zum ersten Mal die Kultivierung von hMSCs in Einweg-Spinner-Flaschen, die mit optischen pH (SP-HP5) und gel?st Sauerstoff (DO, SP-PSt3) Sensoren von PreSens ausgestattet sind. W?hrend eine Peak-Zellzahl zwischen 4,1 × 10⁷ Zellen und 5,9 × 10⁷ Zellen in zwei Kultivierungsl?ufen erreicht wurde, lieferten die Sensoren zuverl?ssige DO- und pH-Daten.

Spinner-Flaschen sind für Kultivierungen von hMSCs im ml-Ma?stab gut etabliert [1-3]. Zum Beispiel kann das Screening von Zellkulturmedien, Microcarrier-Arten und Prozessparametern schnell mit Spinner-Flaschen durchgeführt werden [4]. In der Regel sind sie jedoch nicht instrumentiert und erlauben keine Online-Messung wichtiger Prozessparameter wie DO und pH, die einen starken Einfluss auf die Kultivierungsergebnisse haben. Die vorliegende Studie untersucht die Zuverl?ssigkeit von Sauerstoff- und pH-Werten, die online mit optischen Sensoren von PreSens (Deutschland) w?hrend Microcarrier-basierter Expansionen von aus Fettgewebe gewonnenen humanen mesenchymalen Stammzellen (hADSCs) gemessen werden. Die optischen Sensoren wurden an den Innenw?nden von 125 ml-Spinner-Flaschen (Corning, USA) angebracht. Die optischen Polymerfasern zur Sensoranregung und dem Auslesen der Sensorantwort wurden gegenüber den Sensorspots mit einem ARC (Adapter für runde Beh?lter, PreSens) fixiert und mit einem pH-1 mini und OXY-4 mini verbunden (Abb. 1A). Es muss erw?hnt werden, dass herk?mmliche Sonden wegen des engen Raums zwischen dem Rührer und der Reaktorwand nicht in den verwendeten Spinner-Flaschen installiert werden k?nnen. Daher ist die miniaturisierte Gr??e der Sensorspots im Vergleich zu herk?mmlichen Sonden ein gro?er Vorteil. Darüber hinaus ver?ndern PreSens Single-Use pH- und DO-Sensoren nicht das Flie?verhalten des Kulturmediums in der Spinnerflasche (Abb. 1B).

Material & Methoden

Kultivierungen wurden mit kryokonservierten hADSCs durchgeführt, die zweite Passage stammte von einem einzigen Spender, der darüber informiert worden war und zustimmte. Die Zellen wurden von Lonza Cologne GmbH zur Verfügung gestellt und wurden auf kommerziell erh?ltlichen Polystyrol-Mikrocarriern in einem Serum-reduzierten Medium (5 % FBS) kultiviert, das speziell von Lonza, USA, entwickelt wurde. Parallel zu den instrumentierten Spinnern arbeiteten wir mit Standard-Spinnern (Kontrollspinnern), bei denen keine Sensorspots implementiert waren. Entsprechend den Abtastintervallen wurden Offline-Proben von den Kontrollspinnern genommen. Vor Inokulation mit Zellen wurde 1 g der Polystyroltr?ger (Wachstumsfl?che 360 ??cm?) in die Spinnerflasche überführt. Anschlie?end wurde das serumreduzierte, vorgew?rmte Kulturmedium zugegeben, um ein Arbeitsvolumen von 115 ml zu erreichen. Die Mikrotr?ger / Medium-Suspension wurde drei Stunden gerührt, um die Sensorspots zu tr?nken und die Suspension ins Gleichgewicht zu bringen. Danach wurden pH und DO rekalibriert und 1 × 10⁶ Zellen inokuliert. W?hrend der ersten vier Stunden wurde nicht gerührt, um die Zellanhaftung zu f?rdern. Dann wurde die Kultur bei 60 U/min, 37 °C, 80 % Feuchtigkeit und 5 % CO₂ für eine Kulturdauer von 7 bis 8 Tagen gerührt. Dreifache Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten genommen, um Zelldichten mit dem NucleoCounter NC-100 (Chemometec, D?nemark) zu bestimmen. Die Messungen von Glukose und Laktat wurden mit dem Cedex Bio (Roche Diagnostics, Schweiz) [Daten hier nicht gezeigt] durchgeführt. Zus?tzlich wurde der pH-Wert offline gemessen (Mettler Toledo). Der online pH-Wert wurde neu kalibriert, wenn die Offline-Messung eine Abweichung von 0,1 zeigte.

In Abb. 2 und 3 sind die zeitabh?ngigen Profile der Gesamtzellzahlen, pH (online / offline) und DO (online) Messungen für zwei unabh?ngige hADSC Kultivierungen aufgetragen (Quadrate = optischer Spinner, Punkte = Kontrollspinner). Für alle Kultivierungen wurde eine eint?gige Lag-Phase beobachtet. In Kultivierungsversuch 1 wurde am Tag 7 im optischen Spinner eine Peak-Zellzahl von 5,95 x 10⁷ Zellen erreicht. Im Kontrollspinner wurde am Tag 6 eine Peak-Zellzahl von 5,84 x 10⁷ Zellen gemessen. Die simulierten Wachstumskurven zeigen ein vergleichbares Wachstum innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase für beide Spinnerflaschen. Die Zellen wuchsen mit einer mittleren Wachstumsrate (μ) von 0,83 d^-1 (Verdopplungszeit 20,1 h), vergleichbar mit Ergebnissen früherer Untersuchungen [4]. Nach Erreichen der Peak-Zellzahlen wurde weiteres Zellwachstum vermutlich durch nicht ausreichend zur Verfügung stehende Microcarrier-Oberfl?che verhindert. In Kultivierung 1 (Abb. 2) nahm die DO-Konzentration von 100 % auf 52 % ab, wodurch eine spezifische Sauerstoffverbrauchsrate (qO₂) von 4,7 x 10^-17 mol s^-1 pro Zelle berechnet wurde. Im Vergleich zu Literaturdaten (2,50 x 10^-17 [5] bis 2,25 x 10^-18 mol s^-1 pro Zelle [6]) lag die berechnete Sauerstoffverbrauchsrate für die hMSCs im typischen Bereich. Die Online-Messung zeigte, dass die Probenahme am 3., 5., 6., 7. und 8. Tag Auswirkungen auf das Kultivierungssystem hatte. Der Gasaustausch wurde w?hrend der Probenahme intensiviert, was zu einem erh?hten DO- und pH-Signal (Signalspitzen) führte. Dennoch zeigten die offline pH-Messungen ?hnliche Werte (mittlere Abweichung < 2 %) wie die online Messungen. Die minimale Abweichung zeigt die Zuverl?ssigkeit der online Messungen. Die Anzahl der Probenahmen in Kultivierung 2 wurde verringert (Tag 0, 1, 6 und 7), um den Gasaustausch zu reduzieren. Dementsprechend wurden glattere Signalkurven für pH und DO, ohne abrupte Peaks, erhalten. Die Peak-Zellzahlen (3,45 x 10⁷ Zellen im optischen Spinner, 4,11 x 10⁷ Zellen im Kontroll-Spinner) in Kultur 2 waren etwa 29 - 42 % niedriger als in Kultur 1. Ein vergleichbares Wachstum mit einer mittleren Wachstumsrate (μ) von 0,65 d^-1 entsprechend einer Verdopplungszeit von 25,6 h wurde für den optischen Spinner sowie für seine Kontrolle berechnet. Das reduzierte Zellwachstum zeigte sich auch im DO-Signal, wo eine Abnahme von 21 % (von 100 % auf 79 %) aufgezeichnet wurde. Unter Verwendung der gesch?tzten spezifischen Sauerstoffverbrauchsrate (qO₂) von Kultivierung 1 konnte eine mittlere Zellzahl von etwa 4,14 x 10⁷ Zellen für die Kultivierung 2 vorhergesagt werden.

Zusammenfassung

Diese Ergebnisse zeigen, dass die online DO-Messung verwendet werden kann, um das Zellwachstum in Einweg-Spinner-Flaschen zu beurteilen und vorherzusagen. Darüber hinaus zeigen die online pH-Messungen, dass der reduzierte Gasaustausch eine schnelle Abnahme des pH-Wertes nach der Inokulation bewirkt, was das Zellwachstum beeintr?chtigen kann. Die online pH- und DO-Messungen mit den optischen Sensoren von PreSens erm?glichen eine genaue und zuverl?ssige Messung der beiden wichtigsten Prozessparameter.

Danksagung:
Wir danken dem Team von Dr. Christian van den Bos von Lonza Cologne (Deutschland) für die Bereitstellung der Zellen, Microcarrier, Kulturmedien, und den Wissensaustausch.

Referenzen
[1] D. Schop, et al. (2008), J Tissue Eng Regen Med 4, 126 - 135
[2] S. Kaiser, et al. (2013), Chemie Ing Tech 85, 95 - 102
[3] C. J. Hewitt, et al. (2011), Biotechnol Lett 33 (11), 2325 - 35
[4] C. Schirmaier, et al. (2014), Eng Life Sci
[5] P. Godara (2008), J Chem Tech Biotechnol 420, 408 - 420
[6] Q. a Rafiq, et al. (2013), Biotechnol Lett 35 (8), 1233 - 45