O₂, pH und CO₂ ?berwachung in mikrofluidischer S?ugerzellkultur

Das Zellkulturmedium ist der bedeutendste Kostentreiber für die Kulturfleischproduktion. Die Optimierung des Designs und der Instrumentierung der Bioreaktoren durch zus?tzliche ?berwachungsfunktionen mittels Sensoren kann dazu beitragen, diese Kosten zu senken und die maximale Zellproduktionskapazit?t pro Einheit mittleren Volumens zu erreichen. Scale-Down-Ans?tze werden seit langem in Bioprozessen angewendet, um Scale-Up-Probleme zu l?sen. Miniaturisierte Bioreaktoren haben sich als Instrument zur Gewinnung prozessrelevanter Daten in der frühen Prozessentwicklung bew?hrt. Wir haben dieses Prinzip angewendet, d. h. den "Lab-on-a-Chip"-Ansatz (LoC) bei der Entwicklung einer neuen Generation kostengünstiger Sensoren zur ?berwachung verschiedener Zellkulturparameter wie Biomasse, Ammoniak und Glutamin in Zellkulturmedien. Wir haben unsere speziell gefertigten mikrofluidischen Bioreaktoren verwendet, die mit unserem impedimetrischen Sensor und einem optischen Sensor in Kombination mit den von PreSens bereitgestellten SensorPlugs für O₂, CO₂ und pH erg?nzt wurden. Die Hauptidee unseres Projekts war es, herauszufinden, welche Prozesse im mikrofluidischen Bioreaktor ablaufen, und die Auswirkungen auf das Zellverhalten, die Lebensf?higkeit der Zellen und die Wirksamkeit der Reagenzien zu quantifizieren. Wir haben die Wirksamkeit von PreSens SensorPlugs zur ?berwachung von Bakterien- und S?ugetierzellkulturen in mikrofluidischen Bioreaktoren getestet. Darüber hinaus führten wir eine Reihe von Pilotversuchen mit menschlichem Speichel durch, um die Anwendung der Sensoren für die Geschmacksbewertung des Endprodukts des kultivierten Fleisch-Bioprozesses zu erweitern. Hier werden unsere Ergebnisse für die Zellkulturüberwachung gezeigt.

Die mehrschichtigen MB-Chips wurden unter Verwendung der transparenten und biokompatiblen Materialien Glas und PMMA hergestellt. Die obere und die mittlere Schicht wurden aus PMMA hergestellt und die Verbindungsschichten wurden unter Verwendung von doppelseitigen 3M-Klebeb?ndern (3M GPT-020F, St. Paul, MN 55144-1000, Minneapolis, USA) hergestellt. Die untere Schicht des Chips für die Zellkultur bestand aus Glas, wo der Impedanzsensor mit der handelsüblichen Agfa-Gevaert N.V.-Nanosilbertinte mit 15% Ag-Nanopartikeln und der leitf?higen Tinte unter mit einem piezokontrollierten Tintenstrahldruckers Fuji Dimatix DMP-3000 aufgedruckt wurde. Der Sensor wurde mit einer dünnen Schicht SU-8 3000 Microchem Resist bedeckt. Die oberste Schicht enthielt Einlass- / Auslassl?cher, deren Durchmesser zum Pipettieren der Probe w?hrend des Füllens des Chips angepasst waren. In die oberste Schicht wurden drei L?cher mit einem Durchmesser von 2,1 mm für die Montage der PreSens SensorPlugs eingebracht. Die Sensoren standen durch die L?cher in direktem Kontakt mit der Probe, was eine Echtzeitmessung der Parameter in der Probe erm?glichte. MRC-5-Fibroblasten (ATCC? CCL-171 ?) wurden als Modell eines adh?renten Zelltyps verwendet. Alle Experimente mit MRC-5-Fibroblasten wurden am Institut für Onkologie der Vojvodina, Sremska Kamenica, Serbien, durchgeführt. DMEM mit 10 % FBS wurde als Kultivierungsmedium verwendet.

Bevor irgendwelche Messungen durchgeführt wurden, führten wir Biokompatibilit?tstests der verwendeten Materialien für die Herstellung von MF-Chips durch. MRC-5-Zellen zur Kultivierung wurden in einer Konzentration von 50.000 Zellen/ml in die MF-Chips gegeben. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Kultivierung von MRC-5-Zellen w?hrend 48 Stunden; die Verdopplungszeit- und Wachstumskurve innerhalb des MF-Chips wurde berechnet. Es konnte festgestellt werden, dass die Zellen ohne zus?tzliche Beschichtungsmittel gut am Glas hafteten. Dieser Zelltyp setzt sich schneller ab und bindet an das Substrat, was in der ersten Stunde nach der Inokulation am st?rksten ausgepr?gt ist. Die Gesamtzahl der nach 48-stündiger Kultivierung erhaltenen Zellen betrug 262.500 Zellen/ml mit einer Lebensf?higkeit von 95,45 %.

Die Biomassekonzentration wurde unter Verwendung von UV/VIS-Absorptionsspektren gemessen, die im Nahe-Infrarotbereich unter Verwendung eines Prozessspektrometers und einer faseroptischen Sonde auf der Oberseite des Mikrofluidik-Chips aufgezeichnet wurden. Da lebensf?hige Zellen polarisierbar sind und als Dipole wirken, wurde die Impedanzmessung mit der optischen Messung kombiniert, um Informationen über die Zellkonzentration und eine Absch?tzung der Lebensf?higkeit der Zellen zu erhalten.
In dem vorgeschlagenen Experiment werden impedimetrische und optische Messungen der Biomassekonzentration mit Messungen wesentlicher Zellwachstumsparameter kombiniert: pH, O₂ und CO₂. Die Zellkultivierung wurde in einem statischen Zellkultursystem durchgeführt, in dem sich Zellen nach dem Auss?en unter statischen Bedingungen an das Zellsubstrat anlagern k?nnen. Die Zellen hatten optimale Wachstumsbedingungen, aber die Medien mit N?hrstoffen, die für das Fortschreiten des Kultivierungsprozesses wesentlich sind, waren begrenzt.
Die Messungen wurden innerhalb des Mikrofluidik-Chips mit unterschiedlichen Konzentrationen an lebenden und toten Zellen durchgeführt. Die Lebendzellparameter wurden durch mehrere Experimente überwacht und die Mittelwerte sind in Abbildung 2 dargestellt, w?hrend für die Totzellparameter die Zellen nach einer bestimmten Kultivierungszeit mit DMSO get?tet wurden. Zu diesem Zweck haben wir 6250 Zellen/ml MRC-5-Zellen für die Kultivierung innerhalb der MF-Chips vorbereitet. DMEM, das 10% FBS enthielt, wurde als Kultivierungsmedium verwendet. Die pH-, O₂- und CO₂-Werte wurden im Mediums gemessen und die Zellen unter Verwendung eines Zytometers gez?hlt, w?hrend die Biomasse unter Verwendung eines integrierten impedimetrischen Sensors und optischer Spektroskopie im NIR-Bereich gesch?tzt wurde.
Der anf?ngliche pH-Wert (als wir Zellen innerhalb des MF-Chips ausges?t hatten) bei t = 0 min betrug etwa 7,4. Nach der Kultivierung der Zellen beobachten wir eine Ans?uerung der Kultur, eine Zunahme von % Kohlendioxid und eine gleichzeitige Abnahme von % Sauerstoff w?hrend der Inkubation. Für die geringere Konzentration an Zellen gab es keine signifikanten ?nderungen in allen Parametern. Mit zunehmender Zellkonzentration stieg der CO₂-Gehalt exponentiell an und O₂ nahm exponentiell ab. Im Falle der toten Zellen wurde dem Medium DMSO zugesetzt, was zus?tzlich eine ?nderungen aller Parameter, insbesondere des pH-Werts, verursachte. Es konnten auch signifikante Unterschiede in den gemessenen Konzentrationen der Gase über die Zeit beobachtet werden.

Basierend auf den vorgestellten Ergebnissen k?nnen wir den Schluss ziehen, dass die PreSens SensorPlugs eine bequeme M?glichkeit sind, grundlegende Parameter (O₂, pH, CO₂) in der mikrofluidischen Zellkultur zu überwachen. PreSens SensorPlugs bieten ein wichtiges Werkzeug für die Analyse des Scale-Down-Ansatzes und die Prozessüberwachung bei der Optimierung von Bioprozesskulturen. Zukünftige Experimente werden auf die kontinuierliche ?berwachung und Optimierung von Kultivierungsprozessen gerichtet sein, wobei die Auswirkungen der Zellaktivit?t im Mikrobioreaktor sowie die Auswirkungen der N?hrstoffe auf den Zellwachstumsfaktor untersucht werden. Die Forschung konzentriert sich auf die Ermittlung der Korrelation zwischen den Messwerten von pH-, O₂- und CO₂-Sensoren mit zus?tzlichen Sensoren (impedimetrisch, optisch und elektrochemisch), die in mikrofluidische Bioreaktoren integriert sind, die wir am Institut zur Messung der Leitf?higkeit des Mediums, der Metabolite und der Biomasse entwickelt haben. Die Korrelation zwischen pH, O₂ und CO₂ mit Zellbiomasse und Lebensf?higkeit wird in zukünftigen Experimenten weiter untersucht.