Screening von Pilzmetaboliten in einem mikrofluidischen Bioreaktor

Um mehrere Pilzmetabolite in schneller Folge auf ihre Immunaktivit?t zu screenen, wird ein einfaches und zuverl?ssiges System zur Messung von pH-?nderungen im mikrofluidischen Bioreaktor (MBR) ben?tigt, der vom Institut für Mikrostrukturtechnik (IMT) des KIT in Zusammenarbeit mit dem Botanischen Institut des KIT entwickelt wurde. Dazu wurde eine herausziehbare, aber versiegelnde Verbindung vom PreSens pH-1 SMA HP5 zum entsprechenden Sensorspot SP-HP5 im MBR entworfen und sowohl mechanisch als auch in biologischen Experimenten untersucht. Der MBR ist ein Zweikammer-Bioreaktor, der für die Kultivierung von Pflanzenzellen verwendet wird (siehe Abb. 1A). Eine durchl?ssige Membran trennt die Kultivierungs- und die N?hrstoffflusskammer. Er wurde erstmals von Tim Finkbeiner am IMT [4] konzipiert und weiterentwickelt. ?ber zwei ?ffnungen an beiden Enden der ovalen Kammer k?nnen Zellen in die Kultivierungskammer eingebracht werden. Die ?ffnungen sind mit M5-Gewinden versehen, um sie mit geeigneten Schrauben verschlie?en zu k?nnen. Die MBRs k?nnen über einen unidirektionalen Fluss mit weiteren MBRs verbunden werden. So werden die in der Kultivierungskammer verbleibenden Zellen kontinuierlich mit frischem Medium und Stoffwechselprodukten aus den vorangegangenen MBRs versorgt, w?hrend ihre eigenen Stoffwechselprodukte zu den nachfolgenden MBRs transportiert und Abf?lle abgeführt werden. Das Grundprinzip besteht darin, durch die Kultivierung von Zellen einer Art pro MBR den interzellul?ren Kommunikationsweg zu zerlegen, um Informationen über die beteiligten Prozesse und Reaktionen zu gewinnen. Der pH-Wert wird mit dem pH-1 SMA HP5 quantifiziert, w?hrend Zellen der BY2-Linie von Nicotiana tabacum in der Kultivierungskammer der MBRs kultiviert werden. Dem Medium, das den Zellen zugeführt wird, k?nnen Substanzen zugesetzt werden, deren Immunaktivit?t bewertet werden soll. Sollte ein Anstieg des pH-Wertes zu beobachten sein, kann dies als erster Hinweis auf eine Immunaktivit?t der Substanz von Interesse interpretiert werden.

Zelllinie und Kultivierungsaufbau
Für die Versuche zur BY2-Kultur wurde eine Zellsuspensionskultur von N. tabacum in Murashige- und Skoog-Medium (MS) kultiviert, das 4,3 g/l Murashige-Skoog-Salze, 30 g/l Saccharose, 200 mg/l KH₂PO₄, 100 mg/l Myo-Inositol, 1 mg/l Thiamin und 0,2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigs?ure enthielt. Die Zellkultur wurde w?chentlich subkultiviert, indem 1,5 ml der sieben Tage alten Zellsuspension in 30 ml frisches MS in einem sterilen Erlenmeyerkolben überführt und im Dunkeln bei 26°C auf einem auf 150 U/min eingestellten Orbitalschüttler kultiviert wurde. Um die Zellen im MBR zu kultivieren, wurden 750 ?l der 7 Tage alten Zellsuspension vorsichtig in die Kultivierungskammer des MBR pipettiert und mit Hilfe einer Peristaltikpumpe mit frischem MS-Medium versorgt (siehe Abb. 3 B). Der Fluss wurde in einer unidirektionalen Kreisstr?mung durch den Chip organisiert. Die Peristaltikpumpe pumpte 134 ?l/min durch die Schl?uche.

Messung der Chitosan-induzierten pH-Verschiebung
Es ist bekannt, dass Chitosan in Pflanzenzellen eine Immunreaktion mit einer entsprechenden Verschiebung des extrazellul?ren pH-Wertes hervorruft. In dieser Arbeit wurden die im MBR kultivierten BY2-Zellen mit 25 ?g/ml Chitosan (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Deutschland) und einer entsprechenden L?sungsmittelkontrolle von 0,0025 % Essigs?ure behandelt. Zun?chst wurde der Aufbau wie oben beschrieben in einer Cleanbench installiert, wobei Schl?uche den MBR, die Pumpe und das MS-Mediumgef?? kreisf?rmig verbanden. Dann wurde das MS-Medium mit 134 ?l/min durch das System gepumpt und kurz vor Erreichen des MBR zum ersten Mal gestoppt. 750 ?l der 7 Tage alten Zellsuspension wurden in die Zellkammer überführt. Die Pumpe wurde gestartet, und der Chip wurde aufrecht gedreht, w?hrend er mit MS gefüllt wurde, um das Austreiben der verbleibenden Lufteinschlüsse zu erleichtern. Sobald das MS-Medium aus dem Auslass des Chips auszutreten begann, wurde der Chip in seiner endgültigen horizontalen Position in das Gerüst eingebaut. Vor Beginn der pH-Messung wurde der Sensor im Inneren des Chips 90 Minuten lang ?quilibriert. Anschlie?end wurde der pH-Wert 30 Minuten lang gemessen, um den Basis-pH-Wert zu berechnen. Dann wurde das Chitosan oder die Essigs?ure zugegeben, und der jeweilige Zeitpunkt wurde als 0:00 definiert. Nach der Behandlung wurde der pH-Wert zwei Stunden lang kontinuierlich alle 30 Sekunden gemessen. Für jede Behandlung wurde ein biologisches Triplikat erstellt.

Mechanische Ergebnisse
Die beiden Steckerkonstruktionen mit der durchgebohrten ?ffnung für den Lichtwellenleiter wurden mit einer PC-Folie, PDMS und 3M-Polyesterband 851 ("grünes Band") abgedeckt, um eine dichte Grenze zwischen der Kulturkammer und dem Lichtwellenleiter au?erhalb des MBR zu schaffen. Die PC-Folie konnte in unseren Versuchen nicht ausreichend verklebt werden, aber das 3M-Polyesterband 851 dichtete den Anschlussstecker ausreichend ab. Dieser mit Klebeband abgedichtete Stecker konnte jedoch aufgrund der grünen Farbe und der geringen Lichtdurchl?ssigkeit des Klebebandes nicht für pH-Messungen verwendet werden. Auch das mit PDMS versiegelte Bohrloch wurde dicht verschlossen. Die blind gebohrten Anschlüsse dichteten beide den MBR ausreichend ab. Es gab keinen erkennbaren Vorteil für die Abdichtung des Systems durch eine zus?tzliche Nut und einen zus?tzlichen Dichtungsring im Vergleich zu dem Verbinder ohne diese. Der einfache, blind gebohrte Verbinder dichtete den MBR ausreichend ab. Hinsichtlich der Transparenz zeigte der PDMS-versiegelte Verbinder die niedrigste Transmissionsrate, w?hrend der mit PC-Folie versiegelte Verbinder etwa 95 % des Lichts durchlie? (siehe Abb. 4). Die niedrige Transmission des PDMS k?nnte jedoch auf Probleme beim Messaufbau zurückzuführen sein.

Als n?chstes wurde das Stecker-Sensor-Setup hinsichtlich der Genauigkeit der pH-Messungen getestet. Da die pH-Pufferwerte der Hersteller im Vergleich zum S220-Sensor genau waren, wurden die Messungen mit den angegebenen Werten als Referenz verglichen. Die pH-Werte des jeweiligen Puffers im MBR wurden dreimal bei der jeweiligen Durchflussrate für zehn Minuten (bei Durchflussrate 0 ml/min und 2 ml/min) und für 45 Minuten (bei Durchflussrate 0,2 ml/min) gemessen. Die Boxplots wurden für die kombinierte Datenbasis der drei Messungen erstellt (Abb. 5). Es wurde die absolute Abweichung vom vorgegebenen Pufferwert bestimmt. Für alle drei Bedingungen und alle drei pH-Werte ist der Interquartilsbereich klein und liegt zwischen 0,014 pH und 0,005 pH. Median und Mittelwert sind - abgesehen von der pH-Auswertung im 6-pH-Puffer ohne Str?mungsumlauf - nahezu gleich. Es kann also von einer symmetrischen Verteilung der Messwerte ausgegangen werden.

Vergleicht man jedoch die verschiedenen Anschlüsse mit einer Messung in einem Glasbecher als Referenzsystem, so zeigen die Messungen im MBR eine deutlich h?here Messung desselben Puffers als die Messung im Becherglas (Abb. 6). Dies k?nnte darauf zurückzuführen sein, dass der Sensor für Glasreaktoren und nicht für die Messung durch Polymere ausgelegt ist. Da sich aus der Verwendung unterschiedlicher Anschlüsse kein Muster ableiten l?sst, das mit den unterschiedlichen gemessenen Lichttransmissionen übereinstimmen würde, ist davon auszugehen, dass die unterschiedlichen Transparenzen der verschiedenen Anschlüsse nicht die Hauptursache für den Offset in den Messungen waren.

Biologische Experimente - Chitosan-induzierte pH-Verschiebung
Der mikrofluidische Aufbau wurde wie zuvor beschrieben unter einem sauberen Tisch mit einer Umgebungstemperatur von 25°C installiert. Nach einer 90-minütigen ?quilibrierung des Sensorspots wurde der pH-Wert 30 Minuten lang gemessen, bevor die Substance of Interest (SoI) hinzugefügt wurde. Anschlie?end wurde der pH-Wert zwei Stunden lang kontinuierlich beobachtet, wobei alle 30 Sekunden ein Messpunkt gesetzt wurde.
Der Mittelwert der pH-Werte, die 30 Minuten vor der Zugabe der SoI gemessen wurden, wurde als Basis-pH-Wert betrachtet und zur Berechnung des ΔpH jedes Zeitpunkts (t) verwendet:
ΔpH_(Sol) = pH_(t) - pH_Basiswert
Um festzustellen, ob Chitosan eine pH-Verschiebung hervorruft, musste die durch das Chitosan-L?sungsmittel hervorgerufene pH-Verschiebung von dem bei der Chitosan-Behandlung beobachteten pH-Wert abgezogen werden:
ΔΔpH_chitosan = ΔpH_chitosan - ΔpH_{L?sungsmittel CTRL}
Die sich daraus ergebenden Daten von ΔΔpH_chitosan, ΔpH_chitosan und ΔpH_solvent Kontrolle (CTRL) sind in Abbildung 7 dargestellt. Alle Behandlungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und der Standardfehler von ΔpH_chitosan und ΔpH_{L?sungsmittel CTRL} wurde notiert. Zur Berechnung von ΔΔpH_chitosan wurden die Mittelwerte von ΔpH_chitosan und ΔpH_{L?sungsmittel CTRL} voneinander abgezogen. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen ΔpH_chitosan und ΔpH_{L?sungsmittel CTRL} zu verschiedenen Zeitpunkten wurde mit dem T-Test mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 berechnet und ist als Heatmap oben in Abbildung 7 dargestellt. Die L?sungsmittel CTRL zeigte einen starken Abfall des pH-Wertes, der etwa 15 Minuten nach der Behandlung einsetzte und anschlie?end auf dem gesenkten Niveau blieb. Durch die Chitosan-Behandlung sank der pH-Wert leicht ab und stabilisierte sich wieder auf dem Ausgangswert. In Anbetracht des durch das L?sungsmittel verursachten Absinkens des pH-Wertes deutet das ΔΔpH_chitosan darauf hin, dass Chitosan einen erheblichen Anstieg des extrazellul?ren pH-Wertes bewirken kann, der mit dem pH-1 SMA HP5-System messbar ist.

Aus den Ergebnissen unserer Experimente und den verschiedenen Designs schlossen wir, dass die Lichtdurchl?ssigkeit durch die verschiedenen Steckerdesigns die Messung nicht signifikant zu beeinflussen schien. Es schien jedoch, dass die Polymer-Steckverbinder eine Verschiebung des gemessenen pH-Wertes im Vergleich zu einer Referenzmessung durch ein Glasbecherglas zeigten. Da in den Sensorrichtlinien Glas als geeignetes Reaktormaterial angegeben ist, k?nnte es eine spezielle Kalibrierung geben, um die Lichtbrechung in Glas zu bew?ltigen, die bei Verwendung eines Polymers zu einer Verschiebung der Messwerte führt. Wenn diese Verschiebung verifiziert werden kann - vielleicht durch weitere und anders aufgebaute Tests - und berücksichtigt würde, w?re das pH-1 SMA HP5 mit den entsprechenden Spots geeignet, um pH-Werte in unserem MBR zu messen.
In einem früheren Experiment haben wir best?tigt, dass 25 ?g/ml Chitosan einen Anstieg des extrazellul?ren pH-Werts in BY2-Zellen verursacht, indem wir den pH-Wert mit einem Tisch-pH-Meter mit Elektrode gemessen haben. Mit der gleichen Behandlung soll in dieser Arbeit bewiesen werden, dass eine Kombination aus dem MBR und dem pH-1 SMA HP5 System verwendet werden kann, um den mit der Immunreaktion verbundenen Anstieg des extrazellul?ren pH-Wertes zu beobachten. Nach Beginn der Behandlung war ein signifikanter Anstieg des pH-Wertes nach 15 Minuten zu beobachten (siehe Abb. 7). Diese Verz?gerung erkl?rt sich durch die Zeit, die das behandelte MS ben?tigt, um in den MBR gepumpt zu werden. Die beobachtete pH-Verschiebung deutet darauf hin, dass die Methode zum Screening auf die Immunoaktivit?t von Substanzen auf Pflanzenzellen verwendet werden kann. Durch die Verwendung mehrerer Kan?le und Sensorspots wird es m?glich sein, eine Screening-Methode mit hohem Durchsatz zu etablieren. Darüber hinaus haben wir die Entwicklung von N?hrstoffgradienten in der Kultivierungskammer des MBR aufgrund der ovalen Form der Kammer untersucht. Im Hinblick auf diese Auswertung w?re die Analyse des pH-Wertes in einem gr??eren Bereich, z.B. mit dem VisiSens System, interessant. Allerdings müssten die Sensorfolien perforiert werden, damit der N?hrstoffstrom in die Kulturkammer gelangt, und es müsste ein Montageverfahren für die Sensorfolien etabliert werden.

Danksagung
Wir danken der Firma PreSens herzlich für die M?glichkeit, ihren optischen Sensoraufbau für pH-Messungen zu testen.

Referenzen
[1] Jones, Jonathan D. G.; Dangl, Jeffery L. (2006): The plant immune system. In: Nature 444 (7117), S. 323–329. DOI: 10.1038/nature05286.
[2] Lecourieux, David; Ranjeva, Raoul; Pugin, Alain (2006): Calcium in plant defence-signalling pathways. In: The New phytologist 171 (2), S. 249–269. DOI: 10.1111/j.1469-8137.2006.01777.x.
[3] Demidchik, Vadim; Shabala, Sergey; Isayenkov, Stanislav; Cuin, Tracey A.; Pottosin, Igor (2018): Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. In: The New phytologist 220 (1), S. 49–69. DOI: 10.1111/nph.15266.
[4] Finkbeiner, Tim (2019): Entwicklung eines mikrofluidischen Bioreaktors für die Kultivierung von Pflanzenzellen. Dissertation. Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe. Institut für Mikrostrukturtechnik.