?berwachung des r?umlich-zeitlichen Sauerstoffverbrauchs in lebenden 3D-Krebs-Sph?roiden

Lokale Sauerstoffgradienten sind in allen Geweben vorhanden, sei es natürlich oder künstlich. Die Sauerstoffversorgung des Gewebes beeinflusst die Migration, Proliferation und Differenzierung von Zellen. Hypoxische Umgebungen sind für bestimmte Entwicklungsprozesse notwendig, z. B. ben?tigen embryonale und adulte Stammzellen eine bestimmte Sauerstoffspannung, um ihre Pluripotenz zu erhalten, sich zu differenzieren oder ihre Differenzierung zu erhalten. Hypoxische Mikroumgebungen sind jedoch auch ein typisches Merkmal für Krebsgewebe, da der Stoffwechsel dort hochreguliert ist. Multizellul?re Tumorspheroide (MCTS) gelten als nützliche in vitro Alternative zur Arbeit mit in vivo oder ex vivo Tumormaterial. Sie sind ein leistungsf?higes Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von Krebsmedikamenten, da sie eine Zwischenstufe zwischen 2D-Monolayer-Zellen und regul?ren Gewebestrukturen darstellen. Für die Tumorforschung ist das Wissen über den Sauerstoffgehalt in Sph?roiden und ihren verschiedenen Zonen (Proliferationszone, Ruhezone, nekrotische Zone) von gro?em Interesse. Die mangelnde Sauerstoffversorgung in zentralen Sph?roidregionen kann zu ruhenden oder nekrotischen Kernen führen. Der Oxygenierungsstatus kann als ein Indikator für die Wirksamkeit von Krebsmedikamenten dienen und dabei helfen, geeignete und personalisierte Medikamente zu identifizieren und auszuw?hlen. Für Informationen über zeitlich und r?umlich aufgel?ste Oxygenierung und Hypoxie in lebenden 3D-Zellkulturen gibt es noch keine geeigneten und biokompatiblen Messverfahren. Hier stellen wir eine Technik vor, die eine r?umlich und zeitlich aufgel?ste ?berwachung in 3D-Zellkulturmodellen unter Wachstumsbedingungen über l?ngere Zeitr?ume hinweg erm?glicht. Sie erlaubt automatisierte, nicht-invasive Messungen innerhalb eines normalen Inkubationssystems und liefert 2D-Querschnittsbilder der Sauerstoffprofile.

R?umlich-zeitliche Gradienten wurden mit dem 2D-Sauerstoff-Bildgebungssystem VisiSens TD (PreSens, Regensburg, Deutschland) mit einem speziellen mikroskopischen Imagingaufsatz, bestehend aus einem Mikroskopobjektiv und einer angepassten Anregungslichtquelle (VisiSens TD MIC Kit), aufgenommen. Um die lokalen Sauerstoffkonzentration zu quantifizieren wurden SF-RPSu4 Sauerstoffsensorfolien (PreSens, Regensburg, Deutschland) verwendet. Die Aufnahme von 2D-Einzelbildern oder Zeitreihenbildern sowie die Bildauswertung erfolgte mit der VisiSens ScientifiCal Software. Die Sensoren wurden mittels einer Zweipunktkalibrierung mit 0 % und 100 % luftges?ttigten Medien bei 37 °C kalibriert.
Stücke der O₂-Sensorfolie (Wachstumsfl?che von 0,385 cm?) wurden mit Silikonkleber (Typ SG-1) auf den Boden einer Standard-Petrischale mit 3,5 cm Durchmesser geklebt. Die wei?e optische Isolierschicht wurde von den Sensorfolien abgezogen. Petrischalen mit integrierten Sensoren wurden 1 Minute lang mit Argonplasma behandelt. Dann wurde die sauerstoffempfindliche Folie mit 150 ?l f?talem K?lberserum (FCS) beschichtet, um die Zelladh?sion zu unterstützen. Eine runde PDMS-Kammer mit einem Durchmesser von 0,7 cm wurde um die Sensorfolie gelegt, um die Aussaat der Sph?roide zu vereinfachen und sie w?hrend der Anheftungsphase an ihrem Platz zu halten. 100 ?l MCF-7-Medium mit einem einzelnen 3D kultivierten Sph?roid (Ausgangszellzahl 3000; ca. 500 ?m Durchmesser) wurden auf die Sauerstoffsensorfolie gegeben. Der umgebende Bereich der Petrischale wurde mit MCF-7-Medium gefüllt, um zu verhindern, dass die Proben trocken fallen. Die Sph?roide wurden 24 Stunden lang auf der Oberfl?che der sauerstoffempfindlichen Substrate anhaften gelassen (37° C, 5 % CO₂).

Nach der Aussaat setzt sich das Sph?roid auf der Sensorfolie ab, haftet an und bildet eine halb-sph?roide Struktur auf der 2D-Sensorfolie. Die halbkugelf?rmige Form und die Anheftung an die Sensorfolie werden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie nach CaAM-F?rbung best?tigt (siehe Abbildung 2A). Die limitierte Permeabilit?t und Transparenz des 3D-Gewebes verhindert die Diffusion des F?rbemittels und das Eindringen des Anregungslichts in tiefere Teile des Sph?roids. Dadurch zeigt CaAM eine hellgrüne Fluoreszenz in lebenden Zellen der ?u?eren Sph?roidregion mit einer schwarzen Region im Inneren des Sph?roids. Einige Zellen aus dem ursprünglichen Sph?roid wachsen aus und breiten sich um die Hemisph?re herum aus. Die rote Lumineszenz wird von der Sensorfolie erzeugt. Die halbkugelf?rmige Struktur, die an der planaren Sauerstoffsensorfolie angeheftet ist, erm?glicht es, direkte 2D-Sauerstoffkarten in der Kontaktzone zwischen Sph?roid und Sensorfolie aufzunehmen und jegliche Gradienten im Inneren zu visualisieren. Das Imagingsystem wurde auf die Sensorfolie mit dem aufgeklebten Sph?roid fokussiert. Die Bilder wurden automatisch alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 12 Stunden aufgenommen, um die M?glichkeit einer Langzeitbeobachtung des Sph?roids im Querschnitt zu zeigen.

Abbildung 2B zeigt beispielhafte 2D-Sauerstoffkarten in Pseudofarbe eines Querschnitts eines MCF-7-Sph?roids über eine 12-Stunden-Zeitreihe unter Wachstumsbedingungen. Um 0 Uhr wurde frisches Medium in die Petrischale gegeben, was zu einer erneuten Sauerstoffzufuhr führte. Der innere Kern des Sph?roids wird innerhalb der ersten zwei Stunden schnell wieder hypoxisch, was mit blo?em Auge an den violetten und blauen Farben der Pseudofarbskala deutlich erkennbar ist. Der Sauerstoffgradient durch die Sph?roidregionen wird auch in der 2D-Sauerstoffkarte deutlich sichtbar. Neben der visuellen Pseudo-Farbdarstellung erlaubt das VisiSens-Auswertungsprogramm die freie Auswahl von Regions of Interest (ROIs) für die verschiedenen Bereiche in einem Sauerstoffbild, und liefert Mittelwerte mit Statistiken in den ausgew?hlten Bereichen. Die Sauerstoffkonzentration reicht vom vollst?ndig sauerstoffangereicherten Medium (pO₂ von 150-160 Torr), das das Sph?roid umgibt, über den steilen Gradienten durch die Proliferationszone (100 bis 50 Torr) bis hin zu einer hypoxischen Ruhezone im Zentrum des Sph?roids (bis zu 20 Torr). Eine weitere St?rke der Bild-basierten Sauerstoffkartierung besteht darin, dass die verschiedenen ROIs über die Zeit untersucht werden k?nnen, was zu Erkenntnissen über die zeitlichen Ver?nderungen w?hrend des Experiments führt. Abbildung 2C zeigt einen Vergleich des Mediums, der Proliferationszone und des hypoxischen Sph?roidkerns über einen Zeitraum von 12 Stunden.

Die chemische Analyse von Sph?roiden mit herk?mmlichen F?rbemethoden, wie z. B. mit Indikatorfarbstoffen oder Nanopartikelsensoren, verursachen mehrere schwerwiegende Probleme. Erstens müssen die F?rbemittel oder Partikelsonden alle vorgesehenen Bereiche erreichen, was durch Diffusionsbeschr?nkungen innerhalb des Sph?roids behindert wird, so dass nur die Peripherie des 3D-Sph?roids gef?rbt wird und beurteilt werden kann. Die begrenzte F?rbung von 3D-Gewebsmodellen geht mit der begrenzten Eindringtiefe von sichtbarem Licht in Gewebe einher, so dass die inneren Teile der Sph?roide nicht erreicht werden, insbesondere bei gr??eren Sph?roiden (>250 ?m). Darüber hinaus haben Indikatoren für molekularem Sauerstoff hohe Photobleichungsraten und schwere Phototoxizit?t durch die Bildung von Singulett-Sauerstoff , was eine zeitlich aufgel?ste Sauerstoffüberwachung unm?glich macht. Zudem ver?ndert die Aggregation der Farbstoffe selbst oder in bestimmten Nischen die aufgezeichneten Signale unabh?ngig vom Sauerstoffstatus und führt so zu fehlerhaften Ergebnissen und erschwert die Quantifizierung. Sensor-Nanopartikel liefern normalerweise eine abgeschirmte Mikroumgebung und reduzieren die Freisetzung von Singulett-Sauerstoff bis zu einem gewissen Grad, aber sie ver?ndern die innere Sph?roidstruktur und -integrit?t. Die strukturellen St?rungen k?nnen den Sauerstoff- und N?hrstofftransport innerhalb des Sph?roids ver?ndern, indem sie der Masse gasdurchl?ssige und n?hrstoffundurchl?ssige Materialien hinzufügen.
Die Sensorfolien- und Imaging-basierte Methode überwindet diese Nachteile und erm?glicht die direkte Darstellung von zeitlichen und r?umlichen Ver?nderungen der Sauerstoffversorgung in einem Querschnitt durch das Sph?roid. Die Verwendung planarer Sensorfolien und des VisiSens TD-Systems mit MIC-Konfiguration erm?glicht darüber hinaus eine Langzeitüberwachung w?hrend der Sph?roidkultur unter Wachstumsbedingungen. Dies erm?glicht die Durchführung von Studien im Bereich Tissue Engineering, Medikamententests, Screening oder Krebsforschung.