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Untersuchung der Dosis-Wirkungs-Beziehung an MDCK-II-Zellen
PhoxyCube erm?glicht die Online-Aufzeichnung von O2 in 96 Wells für Toxizit?tsstudien
Sandra Friedrich1, Tobias Naber1, Barbara Goricnik1, Robert Johannes Meier2, Joachim Wegener1
1Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universit?t Regensburg, Regensburg, Deutschland
2 PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
Die Messung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen ist für das Verst?ndnis der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf zellul?re Funktionen unerl?sslich. Dieser Bericht konzentriert sich auf die exemplarische Bewertung von Antimycin A und Malonoben auf die Atmung von MDCK II-Zellen, einem weit verbreiteten Modell für Nierenepithelzellen. Antimycin A, ein bekannter Inhibitor der mitochondrialen Elektronentransportkette, und Malonoben, das als Inhibitor der Succinatdehydrogenase im Zitronens?urezyklus wirkt, werden verwendet, um die mitochondriale Funktion zu st?ren und somit die Zellatmung zu modulieren. Aufgrund der Ver?nderung des Energiestoffwechsels der Zellen durch den Wirkstoff k?nnen Ver?nderungen in der Sauerstoffaufnahmerate durch ?berwachung des Sauerstoffgehalts in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte beobachtet werden, was zur Quantifizierung des Dosis-Wirkungs-Effekts beitr?gt.
The experiments were conducted using the PreSens PhoxyCube device with PhoxyPlate 96 O, 96-well microplates equipped with oxygen sensors, allowing precise monitoring of oxygen consumption in all 96 wells in parallel. This method provides valuable insights into the mitochondrial activity and overall cellular health under the influence of these modulators. By determining the dose-response relationships, the study aims to better understand the mitochondrial toxicity and potential cellular adaptations to these compounds. The findings could have implications for drug screening and the study of mitochondrial dysfunction in various diseases.
Materials & Methods
The oxygenation status was monitored during culture in the incubator at 37°C using the PhoxyCube device (PreSens, Regensburg, Germany) with a PhoxyPlate 96O, a 96-well plate with O2 sensors in each well (see Fig. 1). PhoxyPlate was pre-equilibrated in 95 % air saturated medium at 37 °C in the incubator (5% CO2) for 1 hour followed by a one-point-adjustment at 95 % a.s.. MDCK II cells were seeded in each well of columns 2 to 12 in 500 ?L Phenol red free growth MEM medium (Gibco) + 5 % FCS + Glucose with a seeding density of 450 T/cm? forming a consistent 2D cell layer at the bottom of each well. Row 1 in Fig. 2 is a blank control without cells. Cells were allowed to attach and proliferate for a total of 48 hours. After 24 hours fresh growth medium was exchanged in all wells.
48 Stunden nach der anf?nglichen Aussaat und Proliferation der Zellen wurde das Wachstumsmedium gegen Phenolrot-freies Leibovitz's L15-Medium mit Glukose (Gibco, kurz L15) ausgetauscht, und die Wirkstoffe wurden in die jeweiligen Vertiefungen gegeben. Die Dosen der Prüfsubstanzen wurden in jeder Reihe mit N=5 Wiederholungen um einen Verdünnungsfaktor von 10 verringert. Die Anfangskonzentration von Antimycin A in Reihe A betrug 20 ?M und erreichte schlie?lich 0,02 nM in Reihe H. Für Malonoben betrug die Konzentration in Reihe A 1 ?M und erreichte 1 pM in Reihe H.
Die Zelladh?sion w?hrend der Wachstumsphase wurde mit einem Messintervall von 20 Minuten aufgezeichnet, die Versuchsphase (beginnend mit dem Medium-/Substanzwechsel nach 48 Stunden) wurde mit einem Intervall von 1 Minute aufgezeichnet.
Ergebnisse
In den ersten 48 Stunden der Zellaussaat, Anheftung und Proliferation zeigen alle zellhaltigen Proben aufgrund der starken natürlichen Atmung der MDCK-II-Zellen einen O2-Abfall (siehe Abb. 3) auf unter 10 % a.s. Im Anschluss an die Anheftungs- und Wachstumsphase (48 Stunden) findet das eigentliche Dosis-Wirkungs-Experiment statt. Die Lufts?ttigung der Blankkontrolle ist h?her als in der vorangegangenen Attachment-Phase, da die 5 %-ige CO2-Zufuhr des Inkubators abgeschaltet wurde.
Die Kontrollgruppe zeigt einen Rückgang des Sauerstoffs auf einen Tiefstwert von 18,5 % a.s. Die Zugabe von Antimycin A zeigt eine deutliche und klare dosisabh?ngige Wirkung mit einer weitgehenden Blockierung der MDCK-II-Atmung und dadurch schnell ansteigenden O2-Werten in den Kulturen. Je niedriger die Konzentration des zugesetzten Antimycins A ist, desto verz?gerter und weniger ausgepr?gt ist dieser Effekt. Der Effekt bei Zugabe von Malonoben ist entgegengesetzt, da es ein Atmungs- und ATP-Entkopplungsmittel ist, das die Zellatmung und damit die O2-Abnahme in den Kulturen steigert. Je nach der zugesetzten Malonoben-Dosis ist der Sauerstoffabbau durch die Atmung schneller und ausgepr?gter, was zu einem h?heren hypoxischen O2-Gehalt führt.
Zusammenfassung
Das PhoxyCube in Verbindung mit PhoxyPlate 96 O erm?glicht Hochdurchsatztests zu den Wirkungen pharmazeutisch aktiver Substanzen, wie z. B. Dosis-Wirkungs-Beziehungsstudien an adh?renten Zellkulturen. In diesem Versuch bildeten die Zellen eine konfluente 2D-Zellschicht, und die ?berwachung w?hrend der Kultivierungsphase erm?glichte es, die Zellaktivit?t im anschlie?enden Assay für jede Vertiefung separat zu bestimmen. Wie in diesem Bericht gezeigt, erm?glichten die parallelen Messungen in 96 Wells die Quantifizierung der Dosisreaktion der Zellen. Da PhoxyCube für den direkten Einsatz im Inkubator konzipiert ist, hat es das Potenzial, viele weitere Anwendungen in der biopharmazeutischen und Zellkulturforschung zu verbessern.