Simultane ?berwachung von pH und Oxygenierung in Mikrovolumina von Blut

Faseroptische pH Mikrosensoren und Miniatur-Breitbandspektrophotometrie verbessern die Blutfunktionsanalyse

Die Implementierung eines pH Mikrosensors und eines Miniatur-Breitbandspektrophotometers in einer Gasdiffusionskammer erleichterte die pH-abh?ngige Analyse der Blutsauerstoffbindungseigenschaften. Parallele Aufzeichnungen von pH-Werten und Pigmentabsorption in Mikrovolumina von ungepuffertem Blut bei Gefriertemperaturen ergaben hochaufgel?ste Sauerstoffgleichgewichtskurven.

Seit mehr als einem Jahrhundert entwickeln und verfeinern Forscher Ger?te, um die komplexe Physiologie des Sauerstofftransports zu erfassen und zu verstehen, was eine Vielzahl an derzeit angewandten Methoden hervorgebracht hat [1]. Trotz des technologischen Fortschritts müssen aber immer noch methodische Herausforderungen bew?ltigt werden, insbesondere, wenn Biologen Umwelteinflüsse auf nicht modellhafte Organismen untersuchen. Hier ein paar Beispiele derartiger Herausforderungen:
(1) Die Analyse der Blutsauerstoffbindung erfordert die Kontrolle oder ?berwachung verschiedener Faktoren wie Temperatur, Kohlendioxid und insbesondere pH. Der pH-Wert variiert jedoch mit Ver?nderungen der Blutpigmentoxygenierung aufgrund von Protonenaufnahme oder -freisetzung durch das Pigment selbst (Abb. 1). Hinzugefügte Puffer stabilisieren den pH-Wert w?hrend der Experimente, k?nnen jedoch relevante Reaktionen des Sauerstofftransports auf solche pH-?nderungen, wie sie in vivo auftreten, maskieren oder verzerren [2]. Ein umfassendes Verst?ndnis des Sauerstofftransports erfordert daher die ?berwachung des Blut-pH-Werts gleichzeitig mit der Pigmentoxygenierung in ungepuffertem Blut [3].
(2) H?ufig sind Probenvolumina aufgrund der kleinen Organismusgr??e, problematischer Blutgef??e oder der Entnahme von Teilproben aus lebenden Exemplaren auf nur wenige Mikroliter begrenzt. Dennoch verbrauchen viele Ger?te gro?e Probenvolumina (> 400 μl) bei jeder Messung, auch aufgrund der erh?hten Volumenanforderungen durch herk?mmliche pH-Elektroden, was wiederum die Anzahl experimenteller Replikationen oder gemessener Parameter einschr?nkt.
(3) Bei niedrigen Versuchstemperaturen (< 5 ?C) arbeiten herk?mmliche pH-Elektroden aufgrund von instabilen und langsam ansprechenden Signalen sehr schlecht, was die Blutfunktionsanalyse von z. B. polaren Organismen erschwert.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir eine von Niesel und Thews [4] sowie Sick und Gersonde [5] entworfene und beschriebene Gasdiffusionskammer (Eschweiler Co., Kiel, Deutschland) mit einem PreSens pH Mikrosensor und einem Miniatur-Breitbandspektrophotometer ausgestattet.

Technische Modifikationen
Gasdiffusionskammern werden h?ufig verwendet, um die Blutsauerstoffbindung von winzigen Blutproben zu bestimmen, indem ?nderungen der Extinktion bei charakteristischen Wellenl?ngen als Reaktion auf sich ?ndernde Konzentrationen von Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoffgas überwacht werden. Wir modifizierten eine Gasdiffusionskammer: (1) durch Anschlie?en eines digitalen Miniatur-Breitbandspektrophotometers und einer Deuterium-Halogen- (d.h. UV- und sichtbares Licht) Lichtquelle (Ocean Optics, Deutschland) über Glasfaserkabel und Kollimationslinsen direkt über und unter der Blutprobe, um den Lichtstrahl durch das Probentr?pfchen zu richten; (2) und durch Einführen eines pH - Mikrosensors (PreSens, Deutschland) wie folgt (Abb. 2): Das Spritzengeh?use des pH - Mikrosensors wurde durch Fr?sen eines zylindrischen Kanals in den Probenglashalter eingepasst und mittels Plastikschraube fixiert (Patentnummer 10 2013 011 343 bei DPMA, Abb. 3). Die Stahlnadel, die den Sensor bedeckt, wurde leicht gebogen (ca. 160 ° Winkel), um den Eintritt der Sensorspitze in das Tr?pfchen sicherzustellen. Die Nadel wurde dann durch einen Silikonring eingeführt und die Sensorspitze in den Rand des Probentr?pfchens bewegt, um überm??iges Sensorbleichen durch den Lichtstrahl zu vermeiden. Durch den Silikonring konnte der pH-Mikrosensor in die gasdichte Kammer eindringen, ohne ein Gasleck zu verursachen.

Blutfunktionsanalyse
Eine Blutfunktionsanalyse wurde an zellfreier H?molymphe von antarktischen Oktopoden durchgeführt, die auf der Fahrt der RV Polarstern im M?rz 2012 gesammelt wurde. Vor jeder Messung wurde der pH-Mikrosensor in sechs mit 40 mmol L-1 MOPS ( 3- (N-Morpholino) propansulfons?ure) gepufferten Meerwasserstandards (pH 6,7 - 8,1) bei 0 ° C kalibriert  und der pH-Wert mit Tris-gepuffertem Meerwasserstandard (Dickson, CO 2 QCLab, USA) auf den frei skalierbaren pH korrigiert. Die H?molymphe wurde auf Eis aufgetaut, mit 0,8 ?l 0,2 mmol L-1 NaOH (10 ?mol L-1 Endkonzentration) gemischt, um den pH auf über 8,0 zu erh?hen, und davon 15 ?l auf die Glasplatte gegeben. Um die Sauerstoffgleichgewichtskurven zu kalibrieren, wurde die maximale Absorption bei 100% Sauerstoff aufgezeichnet und die minimale Extinktion durch Regressionsanalyse berechnet [6]. Die Messungen wurden bei konstantem Sauerstoffpartialdruck (pO2, 21, 13, 4, 1 kPa) und bei kontinuierlich abnehmendem Kohlendioxidpartialdruck / pH (pCO2, 0 - 10 kPa / ca. pH 8,1 - 6,8) durchgeführt.

Absorption und pH-Messungen von ungepuffertem Oktopoden-Blut

Mit Hilfe der modifizierten Gasdiffusionskammer konnten wir die pH-abh?ngige Oxygenierung von H?mocyanin antarktischer Oktopoden in nur Mikrovolumina ungepufferter H?molymphe analysieren (Abb. 4). Die kontinuierliche und gleichzeitige Aufzeichnung von Absorption und pH bei nur mittleren Aufzeichnungsintervallen (eine Messung pro 30 s) führte zu hochaufgel?sten Sauerstoffgleichgewichtskurven. Der kleine Sondendurchmesser des pH Mikrosensors von 150 ?m erm?glichte das vollst?ndige Eintauchen der Sondenspitze in das 15 ?l Probentr?pfchen. Ein Verklumpen von Protein an der Sensorspitze und damit eine Signalst?rung traten bei Oktopodenblut aufgrund fehlender H?mostase nicht auf. Im Gegensatz zu pH-Elektroden lieferten pH-Mikrosensoren stabile pH-Messungen mit schneller Ansprechzeit bei 0 ° C Versuchstemperatur (Abb. 4). Die Pigmentoxygenierung nahm sigmoidal zu niedrigerem pH-Wert ab, was die pH-Abh?ngigkeit der für Kopffü?ler-H?mocyanin typischen Oxygenierung unterstreicht [3]. Das Blut antarktischer Okotopden zeigte eine hohe Sauerstoffaffinit?t bei 0 ° C, die durch unvollst?ndige Sauerstoffentladung bei niedrigem pH und niedrigen Sauerstoffpartialdrücken gekennzeichnet war (4).

Zusammenfassung

Mit der Implementierung eines PreSens pH-Mikrosensors und eines Miniatur-Breitbandspektrophotometers in einer Gasdiffusionskammer konnten die aktuellen methodischen Herausforderungen der funktionellen Blutanalyse bew?ltigt werden, mit denen vor allem Biologen zu k?mpfen haben, die die pH-Empfindlichkeit der Pigmentoxygenierung in winzigen Volumina ungepufferten Blutes untersuchen m?chten. Wiederholte Messungen entlang von pH-Gradienten k?nnen bei verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken und Temperaturen durchgeführt werden, und das auch in Blut von Tieren, die nur begrenzte Probenvolumina liefern, ohne dass verschiedene Proben zusammengefasst werden müssen. Simultane und kontinuierliche Aufzeichnungen von pH und Extinktion verbesserten die Datenaufl?sung erheblich und erm?glichten eine detailliertere Analyse der Sauerstoffbindungskurven. Stabile und schnell reagierende pH-Signale bei Gefriertemperaturen erleichterten die Blutfunktionsanalyse eines antarktischen Oktopoden, dessen Blutpigment H?mocyanin eine hohe Sauerstoffaffinit?t aufwies. Zukünftig k?nnten auch pO2- oder pCO2-Mikrosensoren implementiert werden, um konventionelle, aber hoch aufgel?ste Sauerstoffbindungsexperimente entlang eines pO2-Gradienten durchzuführen oder pH-unabh?ngige Effekte der CO2 -Bindung an Blutpigmente zu bewerten.

Referenzen:
[1] Oellermann M., P?rter, H.-O. and Mark, F. C. (2014).  J. Exp. Biol. 217, 1430 - 1436
[2] Brix, O., Colosimo, A. and Giardina, B. (1994). Mar. Freshw. Behav. Physiol. 25, 149 - 162
[3] P?rtner, H.-O. (1990). J. Exp. Biol. 150, 407
[4] Niesel, W. and Thews, G. (1961). Pflügers Archiv 273, 380 - 395
[5] Sick, H. and Gersonde, K. (1969). Anal. Biochem. 32, 362 - 376
[6] Oellermann, M., P?rter, H.-O. and Mark, F. C. (in Vorbereitung). Blue blood on ice: Modulated blood oxygen transport facilitates cold adaptation and eurythermy in an Antarctic octopod