pH-?berwachung in Urin und Tumor-Mikroumgebungen von Ratten

Messungen mit hoher r?umlicher Aufl?sung gesteuert mit dem manuellen Mikromanipulator

Ziel unserer Studie war es, den pH-Wert von Urinproben (< 100 μL) und von Tumor-Mikroumgebungen an?sthesierter Ratten minimal-invasiv zu überwachen. Die kleinen Urinvolumina von Ratten oder M?usen machen pH-Messungen schwierig, da Standard-pH-Elektroden normalerweise ein minimales Volumen von einigen Millilitern ben?tigen, um zu funktionieren. Die Menge an Rattenurin betr?gt jedoch h?ufig < 100 μL, wie in unserer Studie. Zus?tzlich ist das in vivo pH-Monitoring von Tumor-Mikroumgebungen technisch ziemlich schwierig. Der PreSens Manuelle Mikromanipulator (MM) zusammen mit einem nadelf?rmigen (NTH) pH-Mikrosensor bot eine einfache und effektive M?glichkeit, diese Experimente durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der pH-Wert von Urin und Tumor-Mikroumgebungen bei tumortragenden Ratten im Vergleich zu gesunden Individuen und Geweben niedriger war.

Solide Tumoren enthalten verschiedene Zelltypen wie Krebszellen, Stroma- oder Immunzellen, aber auch Proteine ??und verschiedene Botenstoffe [1]. Die Interaktion zwischen diesen Zellen bildet die einzigartige Mikroumgebung des Tumors und beeinflusst sowohl das Tumorwachstum als auch die Tumorentwicklung [2]. Infolgedessen wurden pH-Unterschiede in der Tumor-Mikroumgebung beobachtet. W?hrend der extrazellul?re pH-Wert von malignen soliden Tumoren sauer ist, im Bereich von 6,5 bis 6,9, ist der pH-Wert normalen Gewebes um 7,2 bis 7,5 signifikant alkalischer [3]. Das systemische S?ure-Basen-Gleichgewicht wird zu gro?en Teilen durch renale Ausscheidung von überschüssigen Ionen in den Urin aufrechterhalten. Die Zusammensetzung der Nahrung, das K?rpergewicht sowie der pathologische Zustand, z. B. Krebs, k?nnen den Urin-pH-Wert durch die Produktion bestimmter Ionen und organischer S?uren beeinflussen [4]. Wir testeten daher die Hypothese, ob die Tumorbildung bei Ratten einen Einfluss auf den pH-Wert des Urins hat. In unseren Experimenten wurde ein mikrofaseroptisches pH-Meter mit einem pH-Mikrosensoren in Nadelbauweise (PreSens, Deutschland) verwendet. Die pH-Mikrosensoren sind miniaturisierte Glasfaser-pH-Sensoren mit Sensorspitzen unter 150 μm, die für Messung kleiner Probenvolumina und mit hoher r?umlicher Aufl?sung ausgelegt sind. Für Messungen innerhalb des Tumorgewebes wurde zus?tzlich ein Manueller Mikromanipulator (MM, PreSens, Deutschland) eingesetzt, der eine sicheres Einführen des Mikrosensors und eine pr?zise Lokalisierung innerhalb der Probe erm?glicht.

Material & Methoden

Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (n = 20) mit einem Alter von 31 Tagen und einem Gewicht von 100 - 130 g wurden von Velaz (?netice, Tschechische Republik) bezogen und an Standard-Gehegebedingungen mit einer Temperatur im Bereich von 21 bis 24 ?C, einer relativen Feuchtigkeit von 50 % - 65 % und künstlichem 12:12 h Licht:Dunkel-Zyklus gew?hnt. Die Ratten wurden mit Standardpellets (Peter Mi?ko, Slowakei) gefüttert und tranken nur Leitungswasser. Brustkrebs wurde bei 10 Tieren (NMU-Gruppe) durch 2 intraperitoneale Dosen (50 mg/kg K?rpergewicht) von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (NMU, Sigma, Deutschland) am 43. und 50. postnatalen Tag induziert. Die restlichen 10 Tiere bildeten die gesunde Kontrollgruppe (CON). Das Experiment wurde nach den Grunds?tzen, die laut den Gesetzen Nr. 377 und Nr. 436/2012 der Slowakischen Republiken für die Pflege und Verwendung von Labortieren vorgesehen sind, durchgeführt. Mit dem Ziel, den pH-Wert der Tumorentwicklung über die Zeit zu überwachen, wurden 5 Ratten zuf?llig ausgew?hlt und über einen Zeitraum von 4 Wochen (10. bis 13. postnatale Woche) einmal pro Woche an?sthesiert. Die An?sthesie erfolgte mit Isofluran, das unter einem doppelten Boden in eine Induktionskammer von 1000 ml Kapazit?t eingeleitet wurde. Eine 4%-ige Konzentration von Isofluran-Gas war ausreichend für Kurzzeitan?sthesie (0,2 ml/l Kammervolumen). Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für pH-Messungen in Tumorgewebe ist in 2 gezeigt. In der letzten Woche des Experiments (14. postnatale Woche) wurden Urinproben von jeder Ratte genommen. W?hrend der Handhabung auf einer sterilen Unterlage begannen die Ratten spontan zu urinieren. Der Urin wurde sofort in sterilen Mikror?hrchen gesammelt. Der pH wurde unter Verwendung von pH-Mikrosensoren (PreSens, Deutschland) nach Sammeln des Urins gemessen. Die Latenzzeit für Messungen in einer Probe lag unter 10 Minuten. Die Daten wurden mit der statistischen Software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., USA) ausgewertet. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Mann-Whitney-Tests analysiert. Um zu sehen, ob der pH-Wert von Urin mit der Menge an Tumorgewebe in Ratten korreliert, wurde ein Online-Pearson-Korrelationskoeffizienten-Rechner verwendet (www.soccistatistics.com). Die Signifikanzstufen sind in der Legende jeder Abbildung angegeben.

pH-Me?ergebnisse

Wir fanden heraus, dass der pH-Wert der Mikroumgebung des Tumors im Vergleich zum Gewebe gesunder Individuen nur leicht vermindert war (pH 7,24 - 7,33). Leider hat das unkontrollierte Wachstum und die Ausbreitung des Tumorgewebes eine wiederholte ?berwachung einer r?umlich definierten Tumorregion über mehrere Wochen hinweg erschwert (siehe Abb. 3). Daher konnten unsere Daten keine schlüssigen Ergebnisse darüber liefern, wie sich der pH-Wert w?hrend der Tumorbildung ver?ndert. Es gibt einige Studien, die darauf hindeuten, dass sich der pH-Wert des Urins w?hrend der Krebsentwicklung trotz des S?ure-Basen-Gleichgewichts im Organismus ver?ndert [4]. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich pH-Ver?nderungen im Urin von tumortragenden im Vergleich zu gesunden Tieren (P < 0,001, Tab. 1). Der Urin-pH-Wert zeigte nur eine sehr schwache positive Korrelation (R = 0,21) mit der Menge an Tumorgewebe. Dies ist wahrscheinlich auf die geringe Probenanzahl in diesem Experiment zurückzuführen (n = 10).

Zusammenfassung

pH-?berwachung mit mikro-invasiven, pr?zisen pH-Mikrosensoren wurde für verschiedene experimentelle Anwendungen eingesetzt, einschlie?lich für in vivo pH-Messungen von Tumorgewebe und geringen Urinvolumina. Die Anwendung des Manuellen Mikromanipulators mit seiner μm-Ablesegenauigkeit erlaubte uns eine sichere Insertion und pr?zise Lokalisierung der Mikrosensoren im Gewebe. W?hrend der in vivo pH-?berwachung des wachsenden Tumorgewebes über mehrere Wochen war es jedoch schwierig, eine r?umlich definierte Messregion zu bestimmen. Mit einem genaueren Protokoll hoffen wir, pH-?nderungen der Tumorbildung in zukünftigen Versuchen bewerten zu k?nnen.

Referenzen
[1] Hanahan D., Weinberg R. A., Cell (2011), 144(5), 646 - 74
[2] Yang L. V., Castellone R. D., Dong L., Cancer Prevention - From Mechanisms to Translational Benefits (2012), 3 - 40
[3] Obey I. F., Baggett B. K., Kirkpatrick N. D., Cancer Res. (2009), 69, 2260 - 68
[4] Wright M. E., Michaud D. S., Pietinen P., et al., Cancer Causes Control (2005), 16(9), 1117 - 23