pH-?berwachung in Molkerei-Starterkulturen

Charakterisierung der S?ureproduktion mit optischen Sensoren in Mikrotiterplatten

Starterkulturen werden verwendet, um eine gute und reproduzierbare Qualit?t von Milchprodukten zu gew?hrleisten. In dieser Studie wurde eine einfach anzuwendende Methode entwickelt, um eine gro?e Anzahl von Impfkulturen als Qualit?tskontrolle für Rohmaterialien zu screenen. Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen pH Sensoren wurden auf ihre Eignung zur ?berwachung der S?ureproduktion w?hrend der Milchg?rung getestet. Unterschiede in Inokulum-Typ und in der Gr??e der Kulturen von Lactococcus lactis und Streptococcus thermophilus konnten eindeutig nachgewiesen werden, obwohl es St?rungen gab, die durch im Medium enthaltene Partikel und Fluorophore verursacht wurden. Der neue Ansatz wurde mit dem etablierten CINAC-System verglichen. Diese frühe Studie führte zur Entwicklung einer verbesserten Sensorplatte - der HydroPlate.

Für Messungen mit chemisch-optischen pH Sensoren wurden 10 ?l einer L?sung, die pH-empfindliche und pH-unempfindliche Fluorophore enthielt, in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrolplatte mit rundem Boden (Greiner, Deutschland) getropft. Die resultierende Schichtdicke des so erzeugten Sensors betrug etwa 5 μm. Die Fluoreszenzintensit?t der pH-empfindlichen Indikatorfluorophore wurde durch Verwendung eines Anregungsfilters mit maximaler Transmission bei 492 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz wurde nach Passieren eines Filters mit einem Transmissionsmaximum von 538 nm gemessen. Für die pH-unempfindlichen Referenzfluorophore wurde eine Kombination von 544 nm / 590 nm-Filtern verwendet. Str. thermophilus und Lc. lactis (Danisco, Deutschland) wurden für Milchfermentationsexperimente verwendet. Sie wurden gefriergetrocknet geliefert und bei - 20 °C gelagert. Aliquote von Kulturen (0,5 g, 0,1 g, 0,02 g) beider St?mme wurden jeweils zu 100 ml sterilisierter Phosphatpufferl?sung gegeben. 1,2 ml dieser Inokula wurden in 200 ml Milchmedium (ultrahocherhitzte, homogenisierte Milch, 0,3 % Fett, Mibell, Deutschland) gegeben. Messungen wurden bei 30 ± 0,1 °C und 37 ± 0,1 °C durchgeführt. Jedes Experiment mit den optischen Sensoren wurde 8-fach in einem Fluoreszenzleser (BMG Fluostar, BMG Labtechnologies, Deutschland) durchgeführt. Für jede Messung wurden 200 μl Flüssigkeit pro Vertiefung verwendet. Der pH-Wert in der Mikrotiterplatte wurde ebenfalls mit einem pH-Meter (Mettler Toledo MP220, Mettler Toledo, Schweiz) und einer pH-Mini-Elektrode (Mettler Toledo Inlab? 423, Mettler Toledo, Schweiz) gemessen. Vergleichsexperimente wurden mit dem CINAC-System (Ysebaert, Frepillon, Frankreich) durchgeführt. Das System verwendet 16 pH-Elektroden. Für diese Messungen wurden 200 ml Glasflaschen vollst?ndig mit Medium gefüllt, so dass keine Gasphase zurückblieb. Sie wurden w?hrend des gesamten Experiments geschlossen gehalten. Um erste Kalibrierkurven zu erhalten, wurden Kalibrierl?sungen verwendet, die 90 % Milch enthielten. Die L?sungen wurden durch Mischen von 18 ml Milch mit 2 ml L?sungen von HCl und NaOH in verschiedenen Konzentrationen hergestellt. Messungen wurden alle 10 Minuten für 24 Stunden durchgeführt.

Eigenschaften der Milchfermentation

Abbildung 1 zeigt eine Kalibrierkurve des Sensormaterials. Unter Verwendung von Milch und Einstellen des pH-Werts mit S?ure oder Base unterschied sich die resultierende Kurve signifikant von der Kalibrierkurve mit Pufferl?sung von identischer Ionenst?rke. Auf diese Weise konnten St?rungen, die durch die optischen Eigenschaften von Milch verursacht wurden, überprüft werden. Vergleichsmessungen mit dem CINAC-System wurden unter Sauerstoffausschluss durchgeführt und die Messgef??e wurden nicht bewegt. In den Mikrotiterplatten war die Milch st?ndig Umgebungsluft ausgesetzt und die Platten wurden im Fluoreszenzleser bewegt. Daher wurden zus?tzliche Offline-Messungen in den Platten mit einer pH-Elektrode durchgeführt. Für Experimente mit den pH- Mikrotiterplatten wurden die gefriergetrockneten Inokula von Str. thermophilus und Lc. Lactis bei 30 °C und 37 °C in sterilisierter Milch kultiviert. Aus den gemessenen Werten von I_rel wurde der pH unter Verwendung einer der zwei Kalibrierungskurven, die in Abbildung 1 gezeigt sind, berechnet. Die Kalibrierung mit Milch konnte nur für pH-Werte über 5 entsprechend I_rel > 0,56 verwendet werden (Abb. 2 oben). Für die ersten 3 bis 4 Stunden der Fermentation waren pH-Werte, die auf diese Weise berechnet wurden, ziemlich nahe an Werten, die mit der pH-Elektrode offline gemessen wurden. Die Ergebnisse des CINAC-Systems tendierten ?hnlich wie die pH-Elektrodenmessung in den Mikrotiterplatten und zeigten, dass die Lufteinwirkung und die Bewegung der Platten keinen Einfluss auf den Fermentationsprozess hatten. Unter Verwendung der Pufferkalibrierkurve konnte eine pH-Absch?tzung über die gesamten Messungen durchgeführt werden, wie in dem unteren Diagramm in Abbildung 2 dargestellt ist. Anf?nglich waren die optisch gesch?tzten Werte betr?chtlich h?her als die Elektrodenwerte, stimmten jedoch zwischen 4 bis 10 Stunden Fermentationszeit ziemlich gut überein. Die Referenzmessungen mit dem CINAC-System waren ?hnlich dem der optischen online Sensoren, und auch die Unterschiede zwischen den Inokulumgr??en und Kulturen zeigten ?hnliche Zeitverl?ufe. Mit dem CINAC-System konnten jedoch keine Mindestwerte wie bei der optischen Messung festgestellt werden. Die Fermentation, die bei 37 °C, aber ansonsten identischen Bedingungen durchgeführt wurde, ergab ?hnliche Ergebnisse wie für 30 °C. Die langsamer wachsende Str. thermophilus Kultur zeigte andere Kurvenverl?ufe (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigen, dass die Fermentationsleistung verschiedener Inokulumkulturen unter Verwendung der pH-Messplatten verglichen werden konnte.

Zusammenfassung

Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen Sensoren (Optoden) erm?glichen die parallele Messung von 96 Kulturen. Trotz einiger St?rungen w?hrend der Fermentation konnte das erhaltene Signal verwendet werden, um zwischen Starterkulturen mit unterschiedlicher Aktivit?t zu unterscheiden. Auch St?mme mit unterschiedlichen Fermentationseigenschaften, wie Lc. lactis und Str. thermophilus, zeigten unterschiedliche Formen des pH-Sensorsignals I_rel. Die Hauptvorteile dieses neuen Systems im Vergleich zu etablierten Methoden sind seine Einfachheit, die gro?e Anzahl von Proben, die parallel mit den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemessen werden k?nnen, und die immense Reduzierung des Arbeitsaufwandes. Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen Sensoren sind eine vielversprechende Methode für Tests und Forschungsanwendungen, bei denen eine gro?e Anzahl von Proben untersucht werden muss. Heute wird für diese und ?hnliche Anwendungen eine verbesserte pH-Sensorplatte (HydroPlate) mit optischer Isolierung und geringerer Querempfindlichkeit gegenüber Milchbestandteilen verwendet.

Applikationsbericht nach
John et al., 2003, pH-Sensing 96-well microtitre plates for the characterization of acid production by dairy starter cultures, J Dairy Res. 70 (3), pp. 327 - 333