Sauerstoffverbrauchsraten einer Monolayer anhaftender MDCK II Zellen

Messungen des zellul?ren O₂-Verbrauchs wurden mit dem VisiSens TD Bildgebungssystem zusammen mit SF-RPSu4-Sauerstoffsensoren durchgeführt. Runde Stücke der planaren O₂-empfindlichen Sensorfolien mit 9,6 cm? wurden auf den Boden transparenter Kunststoffgef??e geklebt. Die optische Isolationsschicht (OIW) wurde zur besseren Zelladh?sion von den Sensorfolien entfernt. Die Sensorgef??e wurden 1 Minute lang Argonplasma ausgesetzt, um die Oberfl?che vor dem Auss?en der Zellen zu reinigen und zu sterilisieren. Die Zweipunktkalibrierung der O₂-Sensoren wurde mit Zellkulturmedien mit 0% und 100% Lufts?ttigung durchgeführt. Die Kalibrierwerte wurden mit der PreSens Oxygen Calculator Software von % Lufts?ttigung in Torr umgewandelt. Die automatisierte Zeitreihenaufzeichnung und Auswertung der Bilder erfolgte mit der VisiSens ScientifiCal Software. Der zellzahlabh?ngige O₂-Verbrauch von MDCK II-Zellen wurde in luftdichten Gef??en (kein O₂-Zufluss) mit 9,6 ml L-15-Medium aufgezeichnet. Die Gef??e wurden mit einem speziell angefertigten luftdichten Deckel verschlossen, der mit Blu-Tack? befestigt wurde. Um sicherzustellen, dass die experimentellen Respirationswerte ausschlie?lich vom mittleren Volumen und nicht vom Vorhandensein einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che abh?ngen, die eine zus?tzliche Diffusion von Sauerstoff erm?glicht, wurden die Gef??e unter Ausschluss des Kopfraums vollst?ndig mit Medien gefüllt. Für Vergleichsexperimente wurden drei Kultivierungskammern mit unterschiedlichen H?hen und damit Medienvolumen mit einem offenen System mit Luftraum verglichen. Die Volumina der geschlossenen Systeme lagen im Bereich von 4,8 bis 19,2 ml, das offene System enthielt ein Volumen von 4,8 ml. Sowohl offene als auch geschlossene Systeme hatten eine identische Wachstumsfl?che von 9,6 cm?. MDCK II-Zellen wurden 24 Stunden vor Durchführung der Sauerstoffmessungen mit einer Dichte von 4,5 × 10⁵ Zellen cm^–2 ausges?t. Der Sauerstoffverbrauch wurde in L-15-Medium bei 37 ° C in einem Inkubator unter Wachstumsbedingungen überwacht. Die scheinbare Sauerstoffverbrauchsrate (AOCR) für geschlossene Systeme wurde durch lineare Anpassung der pO₂-Abnahme als Funktion der Zeit bestimmt.

y = A + Bx

wobei -B den AOCR ergibt. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) für offene Systeme wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei ist D der Diffusionskoeffizient von O₂ in Wasser (3,3 10^-5 cm² s^-1), S der zellbedeckte Bereich der Petrischale (9,6 cm²), α der L?slichkeitskoeffizient bei 37 °C (0,94 ?mol cm^-3 atm^-1), h die H?he der Mediums?ule (0,5 cm), pO₂ (h) der Sauerstoffpartialdruck auf der H?he der Zellschicht und pO₂ (0) der Sauerstoffpartialdruck auf der Medienoberfl?che bestimmt bei t = 5 h.

Zun?chst wurden Sauerstoffverbrauchsprofile der MDCK II-Nierenzelllinie in Abh?ngigkeit von der Zellinokulationsdichte aufgezeichnet. MDCK II-Zellen wurden mit fünf verschiedenen Zelldichten, die von konfluenten bis zu stark subkonfluenten Zellschichten reichten, auf die Sauerstoffsensorfolien ausges?t. 24 h nach der Zellinokulation wurde der Sauerstoffverbrauch von MDCK II-Zellen in 9,6 ml L-15-Medium bei anf?nglicher 100% iger Lufts?ttigung in einem geschlossenen System über die Zeit verfolgt. Abb. 2 zeigt die Abnahme des pO₂ in den Medien in Abh?ngigkeit von der anf?nglichen Zellkeimdichte (Kurven: Mittelwert und SD von drei einzelnen Experimenten). O₂ in den Medien wird im Laufe der Zeit von den atmenden Zellen verbraucht. Die beiden h?chsten Zelldichten zeigen lediglich eine lineare Sauerstoffabnahme. Bei geringerer anf?nglicher Zelldichte zeigt die Kurvenform eine st?rkere Krümmung, aufgrund der Zellteilung und einer kontinuierlichen Zunahme der atmenden Zellen auf der Sensoroberfl?che. Offensichtliche Sauerstoffverbrauchsraten (AOCRs) und entsprechende Sauerstoffverbrauchsraten sind in Abb. 2 zusammengefasst.

Darüber hinaus wurden konfluente MDCK II-Zellen in offenen oder geschlossenen Systemen kultiviert. Wie erwartet nahm der pO₂ unterhalb der Epithelschicht mit abnehmendem Mediumvolumen in geschlossenen Systemen schneller ab. Der Sauerstoff war nach t = 1,75 h aufgebraucht, wenn die Zellen in einem geschlossenen System mit einem Volumen von 4,8 ml kultiviert wurden. Wenn das Volumen auf 9,6 ml verdoppelt wurde, fiel der pO₂ innerhalb von t = 3,75 h ab und erreichte in 19,2 ml pO₂ am Ende der 5 h Beobachtungszeit einen Wert von (30 ± 2 Torr). Im offenen System nahm pO₂ zuerst linear auf (97 ± 11) Torr ab und erreichte dann stabile Werte von etwa 80 Torr, was einen Gleichgewichtszustand von O₂-Eintrag und Atmung widerspiegelt. Abb. 3 zeigt den Vergleich der Sauerstoffverbrauchsraten in offenen und geschlossenen Systemen. Die O₂-Profile geschlossener Systeme wurden angepasst und die offensichtlichen Sauerstoffverbrauchsraten (AOCRs) bestimmt.

Sowohl die offene als auch die geschlossene OCR-Bestimmung haben ihre St?rken. Bestimmungen für geschlossene Systeme liefern genaue und schnelle Ergebnisse. Der Aufbau vereinfacht die Berechnung von OCRs, da der O₂-Zufluss nicht berücksichtigt werden muss. OCRs k?nnen direkt durch lineare Anpassung der pO_2-?nderungen über die Zeit, unter Berücksichtigung des verwendeten Volumens der Kammer, bestimmt werden. Die Volumina k?nnen an erwartete OCRs und m?gliche Versuchszeiten angepasst werden. Wenn eine Zellmonoschicht unter statischen Bedingungen in einem offenen System kultiviert wird, erreicht gel?ster O₂ die anhaftenden Zellen nur durch Diffusion. Die Diffusion von O₂ von der Gas-Medium-Grenzfl?che zur Zellschicht wird durch das zweite Fick'sche Gesetz beschrieben. Unter der Annahme, dass Diffusion und Atmung ein Gleichgewicht erreichen und das Kulturgef?? für O₂ undurchl?ssig ist, kann die OCR unter Verwendung von Gleichung 2 berechnet werden. Diese Methode ist technisch unkompliziert und erm?glicht die Untersuchung sequentiell zugegebener Testverbindungen, ist jedoch tats?chlich langsamer.