Sauerstoff- und pH-Effekte von Modulatorwirkstoffen auf SK-MEL-Zellkulturen

Dieser Anwendungsbericht beschreibt die gleichzeitige Online-Aufzeichnung von Sauerstoff- und pH-Werten in adh?renten SK-Mel-Zellkulturen unter Verwendung des PreSens PhoxyCube. Der PhoxyCube ist ein variables Multiwell-Sensor-Leseger?t, das gel?sten Sauerstoff und / oder pH in mehreren Wells verschiedener Well-Plattenformate w?hrend Kultivierung im Inkubator messen kann. Die optischen O₂- und pH-Sensoren werden auf nicht-invasive Weise durch den Boden der Platten ausgelesen. Die Messung erm?glicht die Visualisierung der Zellproliferationskinetik und die Untersuchung der Auswirkungen von Stoffwechselmanipulationen in der Zellkultur in Echtzeit.

O₂- und pH-?nderungen w?hrend der Kultur wurden mit dem PhoxyCube Ger?t (PreSens, Regensburg, Deutschland) mit einer 24-Well-Platte mit O₂- und pH-Sensoren in jedem einzelnen Well (PhoxyPlate 24 OP, siehe Abb. 1 B) aufgezeichnet. Die PhoxyPlates wurden in 95 % luftges?ttigtem Medium (gemessener pH-Wert von 7,6) bei 37 °C im Inkubator (5 % CO₂) für mindestens 3 Stunden eingeweicht und vor?quillibriert. Nach der Vor?quilibrierungsphase wurde mit der PreSens PhoxyCube Reader Software eine Ein-Punkt-Anpassung für O₂ (bei 95 % a.s.) und für pH (bei pH 7,6) durchgeführt. Alle Wells der Plattenspalten 2 bis 6 wurden mit SK-MEL 28-Zellen in Phenolrot-freiem DMEM-Wachstumsmedium (Gibco) + Glucose (500 ?L mit 4,5 g/L Glucose) mit einer Aussaatdichte von 300 T/cm? beimpft. Spalte 1 der 24-Well-Platte enthielt nur Wachstumsmedium ohne Zellen als Blindkontrolle. Nach 24 Stunden wurde das Medium in allen Vertiefungen gegen frisches Wachstumsmedium ausgetauscht.

48 Stunden nach der ersten Zellaussaat wurde das Wachstumsmedium mit Leibovitz's L15-Medium ohne Phenolrot (Gibco, kurz L15), L15-Glucose (ohne Zellen) in Spalte 1, L15-Glucose in Spalte 2, L15 ohne Glucose in Spalte 3, L15-Glucose mit Antimycin A als Atmungsblocker in Spalte 4, L15-Glucose mit Malonobene als Entkopplungsmittel in Spalte 5 und L15-Glucose mit einem Pestizid (1 mM Acetamiprid, 4,45 % (v/v)) als unbekannte Prüfsubstanz in Spalte 6 ausgetauscht. Die Zelladh?sions- und Wachstumsphase wurde mit einem Messintervall von 20 min aufgezeichnet, die Versuchsphase (beginnend mit dem Medien-/Substrataustausch nach 48 Stunden) mit einem Intervall von 5 min.

W?hrend der Anheftungs- und Wachstumsphase verhalten sich alle zellhaltigen Proben hinsichtlich des O₂-Verbrauchs und der pH-Ver?nderung gleich (siehe Abb. 2). Die Blindprobe bleibt konstant bei einem pH-Wert von 7,6 und 95 % a.s. Nach der Anheftung und dem Wachstum der Zellen für 48 Stunden findet der eigentliche Versuch statt. Alle Testreihen (mit jeweils n = 4 Experimenten) beginnen bei etwa 70 % a.s. und pH 6,6 nach Zugabe von Medien und Testsubstanz. Der Blindversuch ohne Zellen ergibt einen konstanten pH-Wert von 7,0 und einen konstanten pO₂-Wert von etwa 100 % Lufts?ttigung (rote Kurven). Die Lufts?ttigung ist h?her als in der vorangegangenen Anheftungsphase, da das CO₂ (5% v/v) im Inkubator ausgeschaltet wurde. SK-MEL-Zellen in regul?rem L15-Medium mit Glukosezusatz (grüne Kurven) zeigen einen leichten und stetigen pH-Abfall über 12 Stunden. Die entsprechende O₂-Kurve zeigt einen Abfall auf 50 % a.s. nach 1 Stunde und beginnt dann langsam anzusteigen, was auf das Eindringen von Sauerstoff zurückzuführen ist. Zellen in glukosefreiem L15-Medium zeigen ein relativ konstantes pH-Niveau bei pH 6,6, w?hrend der pO₂-Wert ebenfalls in der ersten Stunde auf einen Tiefstand von 40 % a.s. f?llt und dann nach 2 Stunden bei 47 % a.s. verharrt (violette Kurven).

Das der Zellkultur zugesetzte Antimycin A (hellblaue Kurven) führt zu einem raschen Anstieg des O₂-Gehalts auf Lufts?ttigung innerhalb von 2 Stunden aufgrund der Hemmung der mitochondrialen Elektronentransportkette, insbesondere von Komplex III, was zu einem starken Rückgang des Sauerstoffverbrauchs führt, da die Zellatmung blockiert ist. Diese Unterbrechung führt auch zu einem Absinken des pH-Werts auf 5,5 innerhalb der ersten 4 Stunden, da die Zellen auf anaerobe Glykolyse umschalten und Milchs?ure als Nebenprodukt produzieren. Malonoben hemmt den mitochondrialen Komplex II, wodurch der Sauerstoffverbrauch durch Beeintr?chtigung des Elektronenflusses durch die Atmungskette verringert wird. Dies führt zu einem Absinken des pH-Werts, da die Zellen dies durch eine verst?rkte anaerobe Glykolyse kompensieren, was zu einer erh?hten Laktatproduktion führt. Daher sinkt der O₂-Gehalt innerhalb der ersten Stunden schnell auf 22 %, und der pH-Wert sinkt stetig, um nach etwa 9 Stunden ein Plateau bei pH 5,5 zu erreichen (orangefarbene Kurven). Das Pestizid Acetamiprid als Testsubstanz führte zu einem schnellen Anstieg des O₂-Gehalts auf lediglich konstante 90 % a.s. und zu einem Absinken des pH-Werts auf pH 6,1 in den ersten zwei Stunden nach dem Start, wo er konstant bleibt (dunkelblaue Kurven).

Wie in diesem Proof-of-Concept-Bericht gezeigt wird, erm?glicht die PhoxyCube-?berwachungsplattform einen detaillierten Einblick in jede Phase der Zellkulturexperimente. Die gleichzeitige ?berwachung von Sauerstoff und pH-Wert in Echtzeit bietet die M?glichkeit, Stoffwechselver?nderungen direkt zu beobachten und bei Bedarf entsprechende Anpassungen vorzunehmen. In den hier beschriebenen Experimenten hat PhoxyCube bereits seinen Wert bei der ?berwachung von Zellkulturen und der Durchführung von Toxizit?ts- und Arzneimitteltests unter Beweis gestellt, kann aber auch in anderen Forschungsbereichen eingesetzt werden. PhoxyCube wird demn?chst in Hypoxie-Studien und beim Tissue Engineering eingesetzt und wird die Optimierung von Assays (Zelllinie, Mediumzusammensetzung usw.) beschleunigen.