Online pH-Messungen in iTube pH Bioreaktoren

Evaluierung des ITR iTube96Readers zur ?berwachung des Wachstums von Insektenzellkulturen für die Biopestizidproduktion

In unseren Experimenten testeten wir TubeSpin50 Bioreaktoren mit integrierten pH-Sensoren (sogenannte iTube pH Bioreaktoren). Wir haben untersucht, ob sie für die Kultivierung von Lymantria dispar Ld652Y-RH-Suspensionszellen geeignet sind. Darüber hinaus wurde die Genauigkeit des ITR iTube96Reader getestet, der eine parallele online pH-?berwachung in bis zu 96 iTubes pH erm?glicht. Die online gemessenen pH-Werte, die mit dem ITR gesammelt wurden, wurden mit offline pH-Messungen eines Benchtop-pH-Meters (Mettler Toledo) verglichen. Schlie?lich bestimmten wir t?glich das Zellwachstum und die Lebensf?higkeit w?hrend einer Kultivierungsdauer von 11 Tagen. Die Analyse der Proben ergab eine erwartete Spitzenzelldichte von 3,0 × 10⁶ Zellen ml^-1 und Lebensf?higkeiten über 92 % der Insektenzellen in den Zellkulturr?hrchen. Online und offline gemessene pH-Werte zeigten eine sehr gute ?bereinstimmung (Abweichung unter ± 1 %).

Insektenzellen und das Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) werden zunehmend zur Herstellung von Biopharmazeutika und Biopestiziden verwendet. Verglichen mit S?ugetierzellkulturen sind Insektenzellen leichter und billiger zu kultivieren. Au?erdem ben?tigen ihre Produkte weniger Produktionszeit und k?nnen in einer Umgebung mit geringer Sicherheitsstufe (Stufe 1) gehandhabt werden [1]. Die Insektenzellen wachsen bei einer Temperatur von ca. 27 °C und haben eine h?here Toleranz gegenüber Osmolarit?t oder Nebenproduktkonzentrationen. Sie ben?tigen kein zus?tzliches CO₂ und vertragen pH-Werte zwischen 6,0 und 6,8. Für Screening-Studien und Prozessentwicklung auf der Basis von Insektenzellen und dem BEVS werden von verschiedenen Autoren [z. B. 2] TubeSpin50 Bioreaktoren (Techno Plastic Products AG) empfohlen. PreSens hat diese kleinen Bioreaktoren mit nicht-invasiven pH-Sensoren (iTubes pH) ausgestattet. In unseren Experimenten testeten wir iTubes pH zum ersten Mal auf ihre Eignung, den pH-Wert in einer L. dispar-Modellzelllinie zu überwachen. Der entsprechende ITR iTube96Reader, der direkt im Schüttel-Inkubator platziert wurde, erm?glichte parallele pH-Messungen in bis zu 96 iTubes pH. Das Auslesen der Sensoren in den R?hrchen wurde mit der ITR-Software gesteuert und aufgezeichnet. Um das ITR-?berwachungssystem zu evaluieren, verglichen wir Online-Werte, die mit dem Ger?t gemessen wurden, mit Offline-Messungen, die mit einem Benchtop-pH-Meter durchgeführt wurden. Für die Analyse des Zellwachstum, nahmen wir t?glich Proben, um die gesamte und die lebensf?hige Zelldichte (TCD, VCD), die Lebensf?higkeit sowie die Substrat- und Metabolitenkonzentrationen zu bestimmen.

Material & Methoden

Wir arbeiteten mit der Zelllinie Ld652Y-RH, die von Prof. Dr. James Slavicek (U.S. Forest Service, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Die Zellen für das Inokulum und die Batch-Kultivierung wurden in modifiziertem ExCell420 (Sigma-Aldrich) Insektenzellmedium mit 5 % Serum Plus Media Supplement (Sigma-Aldrich) und 50 μg l^-1 Gentamicin-L?sung (Sigma Aldrich) vermehrt. Das Inokulum wurde in einem TubeSpin600 Bioreaktor (Techno Plastic Products AG) bei einem maximalen Arbeitsvolumen von 200 ml und einer Ausgangs-VCD von 0,5 × 10⁶ Zellen ml^-1 hergestellt. Es wurde in einem Schüttler (Infors HT Multitron) bei 180 U/min und 25 mm Schütteldurchmesser inkubiert. Am 6. Tag erreichte die Kultur eine VCD von 1,4 × 10⁶ Zellen ml^-1 (exponentielle Phase) und wurde mit einer anf?nglichen VCD von 0,2 × 10⁶ Zellen ml^-1 in die iTubes geimpft. Vor dem Auss?en wurden die pH-Sensoren für 3 Stunden mit 5 ml Medium ?quilibriert. Die inokulierten iTubes pH wurden in einer Halterung auf dem ITR platziert, welches via Bluetooth mit dem Computer und der entsprechenden Reader-Software verbunden war. Die Zellen wurden in den iTubes mit einem Arbeitsvolumen von 20 ml bei 27 °C und 250 U/min kultiviert. ?ber einen Versuchszeitraum von 11 Tagen wurden t?glich zwei iTubes pH (Doppelbestimmung) für die Offline-Analyse entnommen. TCD, VCD sowie Lebensf?higkeit wurden mit NucleoCounter 100 (Sysmex) bestimmt. Die Substrat- und Metabolitkonzentrationen wurden mit dem automatischen Analyseger?t BioProfile 100 Plus (Labor-Systeme Flückinger AG) quantifiziert. Neben online pH-Messungen wurde der offline pH-Wert mit einem pH-Meter (Mettler Toledo) gemessen, das vor jeder Messung mit Puffer pH 4.01 und pH 7.0 kalibriert wurde.

Insektenzellkultur in iTubes pH

Die t?gliche Probenahme und Offline-Datenanalyse von Ld652Y-RH-Zellen, die in iTubes pH kultiviert wurden, zeigte Wachstum und Lebensf?higkeit (Abb. 2A) wie erwartet. Die Lebendzelldichte (VDC) erh?hte sich innerhalb von 8 Tagen auf etwa 3,0 × 10⁶ Zellen ml^-1. Dann gingen die Kulturen in eine station?re Phase über, w?hrend VCD leicht abnahm (11%). Eine Lebensf?higkeit von über 92 % konnte für 5 Tage beibehalten werden und blieb über 85 % bis zum 9. Tag der Kultivierung. Die maximale Wachstumsrate und Verdopplungszeit für die exponentielle Phase wurde zu 0,021 h^-1 und 33,2 h berechnet. Die erhaltene Zellzahl stimmt gut mit den Daten überein, die für die LdFB-Zelllinie in 250 ml Schüttelkolben beobachtet wurden [3]. Eine niedrigere maximale VCD von LdElta (1,5 × 10⁶ Zellen ml^-1) wurde von Betenbaugh et al. [4] beschrieben, wobei die maximale Wachstumsrate von etwa 0,019 - 0,024 h^-1 und die maximale Verdopplungszeit von 28 - 35 h gut mit unseren Ergebnissen vergleichbar sind. Die Abbildungen 2B und C zeigen das Metabolitenprofil von Ld 652Y-RH-Zellen, das ?hnlich dem der Spodoptera frugiperda-Zellinie Sf-9 ist. Die Glukosekonzentration nahm innerhalb von 11 Tagen kontinuierlich von anf?nglich 7,3 g l^-1 auf 4,0 g l^-1 ab. Die Konzentrationen von Glutamin nahmen w?hrend der exponentiellen Phase von 3,8 mmol l^-1 auf 2,2 mmol l^-1 ab und stiegen in der station?ren Phase und der Sterbephase auf 3,2 mmol l^-1 an. Die maximale Ammoniumkonzentration von 2,6 mmol l^-1 wurde am Tag 1 gemessen und nahm bis zum 11. Tag auf 0,7 mmol l^-1 ab. Die pH-Werte in der L. dispar-Zellkultur gingen bis zum 9. Tag konstant von pH 6,5 auf 5,9 zurück (Abb. 2C). Als das Wachstum aufh?rte und die Anzahl lebensf?higer Zellen abnahm (Abb. 2A), stieg der pH-Wert wieder leicht an (3 %, Abb. 2D). Der Vergleich der online mit dem ITR gemessenen pH-Werte (Abb. 3) mit Offline-Werten der t?glichen Probenahme zeigte eine gute ?bereinstimmung mit einer Abweichung von weniger als ± 1 %. Dies zeigt, dass mit dem ITR eine genaue pH-?berwachung w?hrend L. dispar-basierter Prozesse durchgeführt werden kann.

Zusammenfassung

Die Funktion des ITR iTube96Reader in Kombination mit iTubes pH mit integrierten, nicht-invasiven Sensoren wurde für die Lymantria dispar Zelllinie Ld 652Y-RH in einem pH-Bereich zwischen 5,9 und 6,5 erfolgreich evaluiert. W?hrend der Kultivierung lieferte das ITR-System stabile pH-Messungen (± 1 %) ohne funktionelle oder technische Probleme.

Danksagung
Die Autoren m?chten sich bei Prof. Dr. James Slavicek (U.S. Forest Service, USA) für die Bereitstellung der L. dispar-Zelllinie und bei Nancy Hayes-Plazolles (U.S. Forest Service, USA) für die technische Unterstützung bedanken.

Referenzen
[1] R. Eibl, et al. (2014), in Disposable Bioreactors II, Springer, 99 - 125
[2] M. J. De Jesus, et al. (2004), Biochemical Engineering Journal 17, 217 - 223
[3] J. Vaughn, and F. Fan (1997), In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 33, 479 - 482
[4] M. J. Betenbaugh, et al. (1991), Biotechnology Progress. 7, 462 - 467