Tutorials, Webinare und informative Videos über unsere optischen Sensorsysteme
O2-sensitive Mikrokavit?tenarrays zur ?berwachung von 3D Zellkultur
Sauerstoff-Imaging in Spheroiden mit VisiSens TD Technologie
C. Grün1, G. Liebsch2 und E. Gottwald1
1Institut für Funktionelle Grenzfl?chen, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Germany
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany
Durch Mikrothermoforming wird eine Reihe von Mikrokavit?ten in Sauerstoffsensorfolien erzeugt. In diesen Hohlr?umen k?nnen 3D-Zellaggregate kultiviert und der Sauerstoffgehalt mittels Bildgebung quantifiziert werden. Mit Hilfe dieser neuen Plattformtechnologie ist es nun erstmals m?glich, Sauerstoff in der direkten Mikroumgebung von Sph?roiden und Organoiden zu überwachen und damit in vitro nahezu in vivo Bedingungen zu schaffen.
Zellkulturtechnologien sind seit Jahrzehnten ein wertvolles Instrument in der Grundlagenforschung und Arzneimittelentwicklung. In vitro 3D-Kulturen haben im Vergleich zu 2-dimensonalen Kultivierungsans?tzen viele Vorteile, da Schlüsselparameter wie z. B. Zellverhalten, Stoffwechsel und Morphologie den Zellstatus in vivo besser nachahmen und daher besser als Alternative für Tierversuchen geeignet sind. Allerdings wird oft vernachl?ssigt, geeignete Kulturbedingungen einzustellen, um in vivo Bedingungen für die Zellen zu schaffen. So werden Zellkulturen immer noch h?ufig unter Standard-Inkubatorbedingungen mit Luftsauerstoff und 5 % CO2 durchgeführt, was nicht unbedingt der typischen Sauerstoffkonzentration entspricht, der die Zellen im lebenden Gewebe ausgesetzt sind. Dies kann zu einem Zustand der Hyperoxie oder in einigen F?llen zu Hypoxie führen, was wiederum Stress für die Zellen bedeutet. Um die kultivierten Zellen mit Sauerstoffkonzentrationen zu versorgen, die den Bedingungen in vivo besser entsprechen, sind geeignete Messverfahren erforderlich. Viele Sauerstoffmessverfahren, wie z. B. Clark-Elektroden, verbrauchen w?hrend des Messvorgangs Sauerstoff und sind daher in kleinen Kulturen nicht anwendbar. Optische Sauerstoffsensoren hingegen verbrauchen keinen Sauerstoff, k?nnen miniaturisiert und in verschiedenen Ausführungen für unterschiedliche Anwendungen hergestellt werden, was diese Sensoren für die ?berwachung von Zellkulturen immer beliebter macht. Optische Sensoren basieren auf Fluoreszenzfarbstoffen, die mit Sauerstoff reagieren und beispielsweise in Hydrogelen oder Nanopartikeln eingebaut werden k?nnen. Der Fluoreszenzfarbstoff kann auch in einem Polymerfilm immobilisiert werden, und es k?nnen sauerstoffempfindliche Sensorfolien hergestellt werden. Dies erm?glicht sogar die 2-dimensionale Aufzeichnung von Sauerstoffgradienten über einen ganzen Bereich mit einer entsprechenden Bildgebungskamera. Diese Methode wird bereits in vielen mikrofluidischen und Lab-on-a-Chip-Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir die Herstellung eines Mikrokavit?tenarrays mit Sauerstoffsensorik auf der Basis einer optischen Sensorfolie. In diesen Mikrokavit?ten k?nnen Sph?roide kultiviert werden, und Sauerstoff kann ungehindert aus dem darüber liegenden Medium in das 3D-Zellkonstrukt diffundieren, wodurch nahezu physioxische Bedingungen geschaffen werden. Der Sauerstoffgehalt in der Mikroumgebung mehrerer Sph?roide kann gleichzeitig mit der VisiSens Bildgebungstechnologie aufgezeichnet werden, was einen hohen Durchsatz und markierungsfreie Sauerstoffmessungen erm?glicht, ohne die 3D-Zellaggregate in irgendeiner Weise zu st?ren.
Sensorarrays mit der F?higkeit zur Sauerstoffmessung
Für den Aufbau des Mikrokavit?tensensorarrays wird eine 50 ?m dicke Polycarbonatfolie mit einem sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff beschichtet, der in ein Polymer eingebettet ist (PreSens GmbH). Diese Sensorfolie wird auf ein Messingformwerkzeug aufgelegt und die Mikrokavit?tenarrays werden durch ein Mikrothermoforming-Verfahren (Karlsruher Institut für Technologie) hergestellt. Auf diese Weise lassen sich pr?zise Arrays mit einem inneren Mikrokavit?tsdurchmesser von 300 ?m und einer Fase mit 500 ?m Au?endurchmesser am oberen Ende herstellen (Abb. 2 A,B). Die Geometrie der Mikrostruktur ist nicht auf runde Kavit?ten oder die hier genannten Abmessungen beschr?nkt und kann auf die Bedürfnisse des Kunden zugeschnitten werden. Eingepasst in CellCrown? 12 NX (Scaffdex) Zellkultureins?tze sind die Mikrokavit?ten-Sensorfolien im 12-Well-Format erh?ltlich (Abb. 2 C,D). In unserer Studie erwiesen sich die Sensorfolien als nicht toxisch für den verwendeten Zelltyp. Die Zellen wachsen direkt auf der sauerstoffempfindlichen Schicht; plasmabehandelte und kollagenbeschichtete Sensorfolien zeigen sogar ein verst?rktes adh?rentes Zellwachstum. Die Behandlung mit BIOFLOAT? (FaCellitate) hingegen verhindert das adh?rente Zellwachstum und erm?glicht die Bildung von Sph?roiden, indem die Zellen direkt in die Hohlr?ume pipettiert werden (Selbstorganisation). Dies bietet eine bequeme und direkte M?glichkeit, 3D-Zellaggregate zu erhalten.
R?umlich-zeitliche Sauerstoffmessungen in 3D-Kultur
Die Platten mit den Sensorarray-Eins?tzen werden in einer Kammer über der Kamera platziert, und das VisiSens-System nimmt Sauerstoffbilder von unten auf (Abb. 4A). Auf diese Weise k?nnen Echtzeit-Sauerstoffmessungen über ganze Insertbereiche und eine Vielzahl von Sph?roiden durchgeführt werden. Im Gegensatz zu anderen derzeit erh?ltlichen 3D-Zellkultur-?berwachungssystemen bleiben bei diesem Aufbau die Mikrokavit?ten w?hrend der Sph?roid-Kultivierung und der Messungen offen, so dass keine Gefahr einer Hypoxie besteht (Abb. 6). Es entsteht ein Sauerstoffgradient, der der O2-Diffusion aus dem Kulturmedium oberhalb der Mikrokavit?t in das Zellaggregat entspricht, was dem nativen Gef??system in vivo entspricht. Die Diffusion ist nur von oben m?glich, da die Sensormikrokavit?t von unten eine Diffusionsbarriere bildet (Abb. 5). Abbildung 7 zeigt ein Beispiel für ein Sauerstoffbild, das von einem Sensorarray mit insgesamt 120 Mikrokavit?ten aufgenommen wurde. Interessante Bereiche k?nnen in der Mitte einer Mikrokavit?t, der l?ngsten Sauerstoffdiffusionsstrecke durch die 3D-Zellkultur, und in den inneren und ?u?eren Abschr?gungen, dem Diffusionsbereich, ausgew?hlt und verglichen werden. In einem Mikrokavit?tenarray sind die Einzelmessungen unabh?ngig voneinander, da der Gradient in jede Kavit?t einzeln gerichtet ist. Die jeweiligen Grenzschichten werden durch das darüber liegende Medium permanent mit O2 versorgt, identisch mit der Situation in vivo.
Neue Perspektive für viele Anwendungen
Diese Kulturplattform mit Sauerstoffsensorik bietet die M?glichkeit, die Auswirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen auf den Zellstoffwechsel zu testen. Da die Mikrokavit?ten die Bildung von 3D-Zellaggregaten in hoher Anzahl - bis zu 1400 Sph?roide in einer 12-Well-Platte - erleichtern, ist diese Methode nicht nur zeitsparend für Assays, sondern erm?glicht auch die Erstellung einer gro?en Menge von Daten zum Vergleich. Da die Zellen w?hrend des Messvorgangs nicht ver?ndert werden, k?nnen sie sogar für die nachfolgende Verarbeitung/Analyse verwendet werden. In ersten Proof-of-Concept-Experimenten wurde dieser Aufbau für mitochondriale Stresstests verwendet, und nach Zugabe der jeweiligen Testsubstanzen konnten die erwarteten Sauerstoffkonzentrationen in den 3D-Zellkulturen nachgewiesen werden (Abb. 8). Derzeit werden Protokolle für Kardiotoxizit?tstests von pharmazeutischen Wirkstoffen mit dem Mikrokavit?tensensor-Array entwickelt.