O₂, CO₂ und pH Dynamiken im Kapillarsaum

VisiSens? kombiniert mit einem automatisierten linearen Positionierungssystem liefert vollst?ndige Analytkarten

Wir untersuchten das biochemische Transformationspotential im Kapillarsaum (CF) durch Messung der Verteilung gel?ster Gase und des pH-Wertes. Dafür haben wir die VisiSens? A1, A2 und A3 mit einem linearen Positionierungssystem kombiniert, um die Detektoreinheiten in einem Laborexperiment entlang des CF zu bewegen. Mit diesem Aufbau erhielten wir vollst?ndige Bilder der Analytverteilung im CF und die Bilder best?tigten, dass der CF optimale Bedingungen für eine hohe biologische Aktivit?t und biochemische Umwandlung von organischen Verbindungen bietet.

Im Labor wurde eine sogenannte Hele-Shaw-Zelle aufgebaut. Sie war mit Sand gefüllt (H?he = 20 cm), der ein realit?tsnahes Bodensystem mit Abmessungen von 80 x 30 x 5 cm³ nachahmte (Abb. 1A). Zur Integration der Zelle in den Messaufbau wurden Item Aluminiumprofile (Item Industrietechnik GmbH, Solingen, Deutschland) verwendet. Das lineare Positionierungssystem (igus GmbH, K?ln, Deutschland) erm?glichte die gesteuerte Bewegung eines Kameraschlittens entlang jedes Sensorstreifens, der innen an der Glaswand der Hele-Shaw-Zelle angebracht war. Die igus-Komponenten wurden an den Item-Profilen montiert. Es wurden fünf Zonen (A - E, 1A) definiert, die einen Sensorstreifen von 20 × 2 cm² für O₂, CO₂ und pH (PreSens GmbH, Deutschland) enthielten. Salicyls?ure wurde als organische Modellverbindung verwendet, die im CF abgebaut werden sollte. Das Kultivierungsmedium zusammen mit N?hrstoffen wurde in einer H?he von 10 cm in die Zelle gepumpt. Das System wurde unter Verwendung einer Stammkultur von Pseudomonas fluorescence (7 × 10⁷ Zellen/ml) inokuliert. Dadurch entwickelte sich der CF in verschiedenen H?hen entlang der Hele-Shaw-Zelle. Das igus-System verwendet Schrittmotoren für die Bewegung. Ihre Kontrolle wurde mit einem hauseigenen Stepper Driver Shield (bestückt mit Schrittmotortreibern Pololu DRV8825) an einem Arduino Uno R3 realisiert. Der Arduino wurde mit der grbl-Firmware (http://bengler.no/gbrl, Version 0.8 mit einem angepassten Referenzcode, der mit zwei Achsen arbeitet) geflashed. Kurz gesagt interpretiert grbl den g-Code und wandelt diese Befehle in die Bewegung der Schrittmotoren um. Eine neue Version der VisiSens? Software (VisiSens AnalytiCal 4) wurde von PreSens entwickelt, die die gleichzeitige Darstellung von drei verschiedenen Analyten (O₂, CO₂ und pH) erm?glicht und von externer Software getriggert werden kann und umgekehrt. Insbesondere wurde ein Python-Skript (www.python.org) entwickelt, das die Bewegung des Kamerageh?uses durch Senden von g-Code an das Arduino steuerte. Sobald die Position erreicht und best?tigt wurde, wurde VisiSens? ausgel?st, um ein Bild des ausgew?hlten Analyten zu erhalten. Jedes einzelne Bild eines Analyten bedeckt etwa 1,5 × 2 cm² auf einem Sensorstreifen. Um die Verteilung aller drei Analyten über die gesamte H?he des CF sichtbar zu machen, wurde der Kameraschlitten so bewegt, dass angrenzende Bilder sich um 20% überlappten (1B). Die Bilderfassung begann in der unteren linken Ecke in Zone A in der Reihenfolge pH-Wert -> O₂ -> CO₂. Dann wurde der Kameraschlitten nach oben bewegt, um den n?chsten Satz von drei Bildern zu erhalten. Insgesamt wurden 130 Bilder pro Analyt über die Hele-Shaw-Zelle (Zonen A-E) aufgenommen. Die Erfassungszeit betrug etwa 20 Minuten pro Lauf und das System lief über 160 Stunden zuverl?ssig. Die Bildaufnahme wurde mit der neu entwickelten VisiSens? Software durchgeführt und die Bildanalyse mit Matlab (MathWorks Inc., Nattick, USA) realisiert. Matlab-Skripte wurden entwickelt, um die Verteilung von O₂, CO₂ und pH-Wert über die gesamte Hele-Shaw-Zelle basierend auf den aufgenommenen Bildern zu interpolieren.

Wie erw?hnt, wurde Salicyls?ure als Modellverbindung verwendet, um den aeroben Abbau von organischen Substanzen im CF zu untersuchen. In Abb. 2 ist die O₂-Verteilung über die gesamte Hele-Shaw-Zelle aufgetragen. Der obere Teil (20 - 30 cm) ist luftges?ttigt und erscheint somit dunkelrot. Der CF selbst entwickelte sich in einer H?he von 5 - 20 cm. Innerhalb dieser Region lag die O₂ Konzentration bei ca. 70 - 80 % Lufts?ttigung. Aufgrund des aeroben biochemischen Abbaus von Salicyls?ure fiel die O₂-Konzentration in der wasserges?ttigten Zone ab. Dunkelblaue Bereiche zeigen die Regionen, in denen der Sauerstoff fast vollst?ndig verbraucht wurde (ca. 20 % Lufts?ttigung). Mit dem VisiSens? System wurde eine Grenze zwischen der wasserges?ttigten Zone und des CF visualisiert (grüne und gelbe Region in Abb. 2). Hier kann ein ausgewogenes Verh?ltnis zwischen Wassergehalt, O₂-Verfügbarkeit und O₂-Verbrauch angenommen werden. Darüber hinaus erm?glichte das vorgestellte System das Extrahieren vollst?ndiger O₂-Profile über die H?he des CF in den Zonen A - E. Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigen die Profile die Entwicklung von Sauerstoff verbrauchenden Regionen innerhalb des künstlichen Bodensystems. Es kann ferner als ein Bild der Salicyls?ureverteilung verstanden werden, die in den Zonen A - B durch die Einstr?mungseigenschaften und in den Zonen C - E durch die Schwerkraft beeinflusst wurde. Ein Abbauprodukt von Salicyls?ure ist CO₂. In Abb. 3 ist ersichtlich, dass CO₂ im CF oberhalb der wasserges?ttigten Zone gebildet und akkumuliert wurde, in einer H?he von 8 cm entlang der Zonen A - E (Bereiche in Cyan, Grün und Gelb). Da die pH-Karte (Daten nicht gezeigt) keine Artefakte wie Gasblasen zeigte, ist anzunehmen, dass das CO₂ in der flüssigen Phase gel?st war. Die CO₂-Konzentration erreichte in der Zone A ihr Maximum von 5 %. Hier sollte die biologische Aktivit?t und das Wachstum haupts?chlich durch das O₂- und salicyls?urereiche Kultivierungsmedium beeinflusst worden sein, das kontinuierlich in einer H?he von 10 cm in die Hele-Shaw-Zelle gepumpt wurde.

Der CF ist ein hochdynamisches System, das gute Abbauf?higkeiten für organische Verbindungen bietet. Dies ist zum Beispiel bei der Bio-Sanierung von kontaminierten Standorten interessant. Eine Hele-Shaw-Zelle schafft eine recht realistische Anordnung im Laborma?stab, um die Wechselwirkung von organischen Verbindungen mit Mikroorganismen im CF zu untersuchen. Die gr??te Herausforderung besteht darin, die Aktivit?t innerhalb des CF in vier Dimensionen zu erfassen. Diese vier Dimensionen (x, y, z, Zeit) wurden durch die Entwicklung eines automatisierten linearen Positionierungssystems in Verbindung mit einer optimierten VisiSens? Software bewertet. Das System lieferte hochaufgel?ste lokale Konzentrationsmessungen für O₂, CO₂ und pH-Wert, was die Approximation der Analytkarten für die gesamte Hele-Shaw-Zelle erm?glichte. Schlie?lich konnte best?tigt werden, dass der CF optimale Bedingungen für eine hohe biologische Aktivit?t in einem weiten Bereich von O₂-Verfügbarkeit und O₂-Verbrauch bietet. Darüber hinaus erm?glicht die Integration von O₂- und CO₂-Sensorstreifen die Berechnung von Kohlenstoff-Massenbilanzen.

Danksagung
Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft wird dankbar anerkannt (FR536/39-2; Der dynamische Kapillarsaum - ein multidisziplin?rer Denkansatz, Teilprojekt 5, DyCap II).