Nicht-invasives Verfahren zur Echtzeit-?berwachung von Sauerstoff w?hrend der Kultur von h?matopoetischen Stamm- / Progenitorzellen (HSPC)

Der SDR SensorDish? Reader von PreSens erm?glichte die Quantifizierung von Sauerstoffkonzentrationen in vitro w?hrend der Kultivierung von h?matopoetischen Stamm- / Vorl?uferzellen (HSPC), die aus menschlichem Nabelschnurblut isoliert worden waren. Der Einfluss simulierter physiologischer Sauerstoffkonzentrationen auf die HSPC-Proliferation, den Zellzyklusstatus sowie die Expression von Markern des Stammzellph?notyps oder differenzierter Zelltypen wurde gleichzeitig mit Echtzeit-?berwachung der Sauerstoffkonzentrationen in den Zellkulturmedien untersucht. Diese Studie demonstrierte die Nützlichkeit dieses Systems zur Untersuchung des Zellph?notyps und der Zellfunktion unter Bedingungen, die die in vivo Sauerstoffumgebung effektiv nachahmen.

Die Sauerstoffkonzentrationen ?ndern sich w?hrend der Entwicklung des menschlichen Embryos dramatisch. Diese Ver?nderungen der Sauerstoffkonzentration sind am st?rksten in der sich entwickelnden Plazenta. Trophoblastzellen geh?ren zu den frühesten Zelltypen, die sich in der menschlichen Plazenta bilden, und müssen sich daher bei vielen unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen entwickeln. In ?hnlicher Weise werden h?matopoetische und vaskul?re Vorl?uferzellen in der frühen Plazenta zuerst in einer sauerstoffarmen Umgebung vorgefunden. Mit fortschreitender Entwicklung nehmen die Sauerstoffspannungen zu und sowohl die Trophoblasten als auch die Vorl?uferzellen passen sich an die steigenden Sauerstoffkonzentrationen an. Wechselwirkungen zwischen Trophoblasten und Gef??zellen sind ?u?erst komplex und wurden noch nicht ausreichend beschrieben. Es ist bekannt, dass Ver?nderungen der Sauerstoffkonzentration direkte Auswirkungen auf die Differenzierung von Trophoblasten und Gef??zellen haben. Abnorme plazentare Sauerstoffkonzentrationen beeinflussen ebenfalls Wachstum und Entwicklung des F?tus und k?nnten schlie?lich zu einem erh?hten Risiko für fetale und mütterliche Morbidit?t und Mortalit?t führen. Aus diesem Grund ist es ?u?erst wichtig, dass Untersuchungen zu den Auswirkungen der Sauerstoffkonzentration auf das Wachstum der Plazenta und die Entwicklung der Gef??e fortgesetzt werden. Ein in vitro Kultursystem, das diese Ver?nderungen der physiologischen Sauerstoffkonzentrationen w?hrend der in vitro Zellkultur effektiv imitiert, würde sich in zukünftigen Studien als unersetzbar erweisen.

CD133⁺ HSPC-Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut isoliert worden waren, wurden für bis zu einer Woche in OxoDishes? mit 24 Wells von PreSens kultiviert. Alle 2 - 3 Tage wurden die Zellen und Kulturmedien entnommen, kurz zentrifugiert (1500 U/min; 5 min) und die Zellen sorgf?ltig in Medien resuspendiert, die für 1 h in der geeigneten Sauerstoffkonzentration (1 %, 8 % oder 20 %) vorinkubiert worden waren. Umgebungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt wurden in dieser Zellkulturstudie mit einer Hypoxiekammer (Billups-Rothenburg, USA) erzeugt, die in einem herk?mmlichen CO₂-Inkubator platziert wurde (Abb. 1). Dieser Aufbau erm?glichte die ?berwachung und Aufrechterhaltung spezifischer physiologischer Sauerstoffkonzentrationen in vitro. Sauerstoffkonzentrationen wurden online und in Echtzeit w?hrend der gesamten Inkubationszeit mit dem SDR überwacht. Gleichzeitig wurden HSPC-Zellen je nach Test in Platten mit entweder 24 oder 6 Wells und unter identischen Bedingungen, kultiviert. Wenn das Medium ausgetauscht wurde, wurde ein Aliquot entfernt und die Zellzahl unter Verwendung eines Casy? Counters bestimmt. Die durchflusszytometrische Messung des DNA-Gehalts erm?glichte die Untersuchung des HSPC-Zellzyklusstatus nach Kultur in physiologischen (1 % oder 8 %) oder Umgebungs-Sauerstoffkonzentrationen (20 %). In ?hnlicher Weise wurden die Apoptoseniveaus unter Verwendung des FITX-Annexin-V-Apoptose-Kits (BD) in Kombination mit Durchflusszytometrie quantifiziert. Auf Proteinebene wurden Expressionsmuster extrazellul?rer Marker von Stamm- / Progenitor- oder differenzierten Zellen unter Verwendung der multiparametrischen Durchflusszytometrie analysiert (Ergebnisse nicht gezeigt).

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die in vitro Sauerstoffspannungen, die mit dem SDR in Kombination mit OxoDishes? w?hrend einer zweit?gigen HSPC-Kultur in verschiedenen Sauerstoffumgebungen gemessen wurden. Eine durchschnittliche Sauerstoffspannung von 10,2 (± 5,5) mmHg konnte aufgezeichnet werden, wenn HSPC in 1 % O₂ kultiviert wurden, und 65,0 (± 7,5) mmHg, wenn sie in 8 % O₂ gehalten wurden. In Umgebungssauerstoff (20 % O₂) betrug die durchschnittliche Sauerstoffspannung in HSPC-Kulturmedien 157,9 (± 9,2) mmHg. Um eine relativ stabile sauerstoffarme Umgebung zu erhalten, wurde in 24-Stunden-Intervallen die Atmosph?re in drei Stunden 1-mal pro Stunde ausgetauscht. In hyperoxischen Umgebungen zeigten HSPC eine erh?hte Proliferationsrate. HSPC-Wachstumskurven nahmen in einer sauerstoffkonzentrationsabh?ngigen Weise ab, wobei die geringste Zellproliferation in Umgebungen mit 1 % O₂ beobachtet wurde (3). Die durchflusszytometrische Analyse des HSPC-DNA-Gehalts erm?glichte die Analyse des Zellzyklusstatus. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten deutlich, dass die Anzahl der ruhenden (d. h. G0) oder G1-Zellen signifikant anstieg, wenn die Sauerstoffkonzentration in der Umgebung abnahm. Die Sauerstoffkonzentration schien in diesem Experiment keine signifikante Auswirkung auf die HSPC-Apoptose zu haben (Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass, wenn HSPC unter Bedingungen kultiviert werden, die die in vivo Umgebung nachahmen, die Zellproliferation am wahrscheinlichsten aufgrund einer Zunahme der Anzahl ruhender Zellen (G0) und ohne signifikante Auswirkungen auf den Zelltod abnimmt. Diese Studie zeigt, dass die Sauerstoffkonzentration definitiv eine Wirkung auf den Ph?notyp und die Funktion von Stamm- / Vorl?uferzellen hat und begründet die These, dass Sauerstoff eine Schlüsselrolle bei der Plazentalentwicklung spielt.

Neue Perspektiven für nicht-invasive Sauerstoffüberwachung

Physiologische Sauerstoffkonzentrationen w?hrend verschiedener Zeitpunkte in der Entwicklung der menschlichen Plazenta konnten effektiv und mit überraschender Genauigkeit unter Verwendung von zwei verschiedenen Gasgemischen nachgeahmt werden, die entweder 1 % oder 8 % O₂ (5 % CO₂) enthielten. In dieser Studie vorgenommene Messungen mit dem SDR zusammen mit OxoDishes? lieferten zus?tzliche Beweise, dass traditionelle Zellkultur bei Luftsauerstoff (20 % O₂) eine deutlich hyperoxische Umgebung mit Sauerstoffspannungen erzeugt, die über dem normalen pO₂ in menschlichen Geweben liegen. Die Verwendung von Gasgemischen mit geringem Sauerstoffgehalt ist in der Plazentaforschung nicht neu. Ein wichtiger Unterschied besteht jedoch darin, dass frühere Untersuchungen keine nicht-invasive Echtzeit-Sauerstoffüberwachung beinhalteten. Wie in dieser Untersuchung deutlich gezeigt wurde, sind die Sauerstoffkonzentrationen in Zellkultursystemen mit niedrigem Sauerstoffgehalt in einem konstanten Fluss und nur schwer bei physiologischen Niveaus zu halten. Dementsprechend war eine Standardisierung der Versuchsparameter (z. B. Zellzahl, Medienzusammensetzung, Gaswechselintervalle usw.) und umfangreiche Tests erforderlich, um sicherzustellen, dass die tats?chlichen physiologischen Sauerstoffkonzentrationen erreicht und anschlie?end aufrechterhalten wurden. Unter Verwendung standardisierter Protokolle wurde die Variabilit?t zwischen den Experimenten verringert. Darüber hinaus lieferte das SDR Sauerstoffüberwachungssystem verl?ssliche Daten über in vitro Sauerstoffkonzentrationen w?hrend der gesamten Versuchsdauer. Reproduzierbare Ergebnisse dieser Studie haben einen klaren Zusammenhang zwischen Sauerstoffkonzentration, Zellproliferation und Zellzyklusstatus gezeigt. Die Bedeutung dieser Ergebnisse für die Stamm- / Vorl?uferzellkultur und -funktion wird in Zukunft genauer untersucht werden. Das SDR erm?glicht in vitro Studien, in denen definierte, physiologisch relevante Sauerstoffkonzentrationen und stabile Zellkulturbedingungen eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus k?nnen Medienver?nderungen oder ?nderungen der Sauerstoffkonzentrationen in den Experimenten entsprechend überwacht und ver?ndert werden. Mit diesem System werden Forschungsziele zeitnah erreicht und damit die Forschungskosten gesenkt.