Wieviel O₂ ist wirklich in Ihrer Zellkultur?

Der Nobelpreis für Medizin 2019 hat alle darauf aufmerksam gemacht, dass S?ugetierzellen auf perizellul?re Sauerstoffkonzentrationen mit sehr komplexen, gewebespezifischen und streng kontrollierten Ver?nderungen der Genexpression reagieren, was zu Ver?nderungen des Stoffwechsels und anderen Aspekten der Zellphysiologie führt. Die meisten bekannten Fakten über die zellul?re Reaktion auf verschiedene O₂-Niveaus wurden aus der Untersuchung von Zellen in Gewebekulturen gewonnen. Anhaftende Zellen werden routinem??ig unter statischen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosph?re von 95% Umgebungsluft und 5% CO₂ bei 37 ° C gezüchtet. Es ist bekannt, dass die H?he der Kulturflüssigkeit, die die anhaftenden Zellen bedeckt, entscheidend ist, um eine ausreichend schnelle Diffusion von O₂ von der Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che zum Boden der Kulturschale zu erm?glichen. Die Details dieses vertikalen Sauerstoffgradienten (VOG) sind jedoch nur wenig bekannt, da er von mehreren Parametern beeinflusst wird: (I) der Respirationsrate der Zellen, (II) der Zellzahl pro Fl?cheneinheit, (III) der Zusammensetzung des Mediums , da es bestimmt, welche Stoffwechselwege aktiv sind, (IV) das Gesamtvolumen des sauerstoffhaltigen Mediums und (V) die Geschwindigkeit des Eindringens von O₂ aus der Atmosph?re in das Medium. Daher ist die Sch?tzung des VOG von der Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che (Quelle) zu den Zellen am Boden der Schale (Senke) (siehe Abb. 1) ein multifaktorielles Problem, das eine experimentelle Bewertung für verschiedene Zellkulturbedingungen und -geometrien erfordert. Detailliertes und zeitaufgel?stes Wissen über diesen Gradienten erm?glicht eine bessere Kontrolle und Standardisierung der O₂-Niveaus, mit denen Zellen konfrontiert sind. Es ist offensichtlich, dass Unterschiede in der Sauerstoffversorgung der Zellen eine potenzielle Ursache für eine schlechte Reproduzierbarkeit von Zellexperimenten von Labor zu Labor sein k?nnen, da pO₂ den Energiestoffwechsel direkt beeinflusst und als starker Hebel für die Genexpression und ph?notypische Ver?nderungen fungiert.

Das MIOS-System wurde in NRK-Zellkulturen mit einer Flüssigkeitsh?he von ca. 6 mm, vom Boden der Kulturschale bis zur Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che, angewendet. Das MIOS deckt die volle Flüssigkeitsh?he von 0 bis 6 mm ab und erm?glicht eine kontinuierliche ?berwachung des VOG. Abbildung 3A zeigt die Imaging-Daten des im Medium entstandenen VOG in Pseudofarben codiert. Die linke Seite zeigt Bedingungen nahe der Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che. In diesen obersten Flüssigkeitsschichten bis zu 2 mm unterhalb der Grenzfl?che entspricht die mittlere O₂-S?ttigung den Inkubatorbedingungen (95 % Lufts?ttigung). Offensichtlich kompensiert der über die Grenzfl?che (1,4 cm²) eindringende Sauerstoff aus der Umgebungsluft die Sauerstoffdiffusion zu den verbrauchenden Zellen. Tief in der Zellkulturflüssigkeit (2 bis 4 mm von der Oberfl?che entfernt) wird ein ann?hernd konstanter Gradient beobachtet. Innerhalb dieser Zone nimmt der Sauerstoffgehalt von 95 % Lufts?ttigung auf 38 % Lufts?ttigung in 2 mm Abstand von den Zellen ab. Dieser nahezu lineare Gradient zeigt die zunehmende Sauerstoffabnahme in den verschiedenen Flüssigkeitsschichten, verursacht durch die Atmungsaktivit?t der Zellen und eine unzureichend schnelle diffusive O₂-Zufuhr von der Grenzfl?che. In der Flüssigkeitsschicht 1 mm über der Zellschicht f?llt der lokale O₂-Gehalt auf 20% Lufts?ttigung nahe an der Zelloberfl?che. Es entsteht eine Verarmungszone, und die Zellen am Boden der Schale weisen einen signifikant niedrigeren O₂-Gehalt auf, als dies aufgrund des O₂-Gehalts in der Inkubatoratmosph?re und der L?slichkeit von O₂ in physiologischen Puffern zu erwarten w?re. In Wirklichkeit sind Zellen schweren hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, wenn sie in einem normoxischen Inkubator gezüchtet werden. Die damit einhergehenden Ver?nderungen des Energiestoffwechsels und des funktionellen Zellph?notyps müssen noch untersucht werden, beispielsweise durch systematischen Vergleich von Zellen unter statischen und unter Flie?bedingungen.
Beim Wechsel von der lokalen zur zeitabh?ngigen Analyse kann die O₂-Konzentration innerhalb von 0,3 mm Mediumh?he über der Zellschicht (= Volumen von Interesse VOI) im gleichen Experiment 24 Stunden nach dem Mediumaustausch (Abb. 4) quantitativ erfasst werden. Das VOI wurde alle 10 Minuten gemittelt und als Funktion der Zeit aufgetragen (Abb. 4B). In den ersten 6 Stunden nach dem Mediumaustausch nahmen die O₂-Werte im VOI von anf?nglich 55 % Lufts?ttigung auf konstante Werte von 20% Lufts?ttigung ab, was auf hypoxische Zust?nde nach einer Kulturzeit von nur 6 Std. unter den Bedingungen in diesem Experiment (6 mm Flüssigkeitsh?he) hinweist. Das anf?nglich sauerstoffhaltige, frische Medium ist aufgrund der kontinuierlichen Zellatmung und der unzureichenden O₂-Eintritts- / Diffusionsrate an O₂ abgereichert. 20 % Lufts?ttigung, der station?re Zustand nach 6 h, betragen 1,35 mg/l oder 42,1 ?mol/l O₂ im VOI.

NRK-Zellen wurden unter Bedingungen, die allgemein als "Standardbedingungen" angesehen werden, bei 37 ° C in einem herk?mmlichen Inkubator mit stabilen 5 % CO₂ in der angefeuchteten Atmosph?re kultiviert. Die verbleibenden 95 % der Inkubatoratmosph?re bestanden aus 20,9 % O₂ bei 1020 mbar Umgebungsluftdruck. Somit betr?gt der O₂-Gehalt unter normoxischen Bedingungen 19,9 % (142,9 Torr) oder in w?ssrigen Medien (physiologischer Salzgehalt) 6,4 mg/l oder 199,9 mol/l gel?sten Sauerstoff. Es wird allgemein angenommen, dass lebende Zellen in Kultur w?hrend ihrer gesamten in vitro Lebensdauer diesem pO₂ ausgesetzt sind. Da Zellen jedoch O₂ mit individuellen Raten verbrauchen und der O₂-Eintrag in Zellkulturgef??en mit unterschiedlichen Geometrien unterschiedlich ist, ist der tats?chliche pO₂, dem die Zellen ausgesetzt sind, h?ufig signifikant unterschiedlich. Dies kann für Unterschiede in der Stoffwechselaktivit?t oder sogar für funktionelle Ph?notypen verantwortlich sein. Dementsprechend ist es für standardisierte und reproduzierbare Zellkulturexperimente obligatorisch, die lokale O₂-Verfügbarkeit in einem bestimmten experimentellen Szenario zu kennen und zu kontrollieren. Der vorgestellte MIOS-Sensor hilft dabei, die aktuellen Einschr?nkungen bei der Beurteilung der lokalen O₂-Verfügbarkeit in Kulturen zu überwinden. Zusammen mit dem VisiSens? Aufbau erm?glicht es die Messung des VOG in Zellkulturflüssigkeiten zwischen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfl?che und der Zellschicht am Boden von 24-Well Platten. Unsere Studie zeigt deutlich, wie sich die Sauerstoffversorgung im Medium sowohl im vertikalen Profil als auch im Laufe der Zeit ?ndert. Die Daten belegen quantitativ, dass Zellen, die nominell unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden, in ihrer direkten lokalen Mikroumgebung eine Hypoxie erfahren. Der Grad der O₂-Abreicherung im perizellul?ren Bereich ist multifaktoriell und h?ngt als solcher von der Flüssigkeitsh?he und der Stoffwechselaktivit?t der untersuchten Zelle ab. Die MIOS-Technik bietet quantitative Einblicke in die tats?chlichen O₂-Niveaus in der zellul?ren Mikroumgebung, wenn sie unter "standardisierten" Inkubatorbedingungen mit 95 % Lufts?ttigung kultiviert wird. Es zeigt den Grad der Hypoxie für gegebene experimentelle Einstellungen und kann die Grundlage für eine genauere Standardisierung der Zellkulturbedingungen und eine verbesserte Reproduzierbarkeit von zellbasierten Assays sein.