Anaerobes intestinales Milieu und Sauerstoffkontrolle

Der Darm beherbergt ein kommensales Mikrobiom, das eine entscheidende Rolle für seine Physiologie und Funktionalit?t spielt. Einige der im Darm lebenden Mikroorganismen ben?tigen anaerobe Bedingungen, um zu überleben. [1] Für den Dünndarm wurde ein Sauerstoffgehalt von 4,1-4,5 % im Darmlumen angegeben. [5] Um diese anaerobe Darmumgebung und sauerstoffkontrollierte Bedingungen in vitro zu erreichen, sind daher im Allgemeinen spezielle Techniken und Ger?te mit Inertgasen wie Stickstoff und Argon erforderlich.
Im Bereich der Mikrofluidik für Zellkulturen bestehen die meisten Plattformen für Intestine-on-a-Chip-Modelle aus PDMS (Polydimethylsiloxan). [2] PDMS ist jedoch sehr durchl?ssig für Gase und Wasserdampf und neigt au?erdem dazu, lipophile Verbindungen unspezifisch zu adsorbieren. [3,4] Daher stellt die Verwendung neuer Materialien mit geringer oder gar keiner Gasdurchl?ssigkeit eine Alternative für die Simulation einer anaeroben Umgebung dar, indem die Sauerstoffkonzentration wirksam kontrolliert wird.
Beonchip verwendet zyklische Olefinpolymere (COP) für die Herstellung seiner Ger?te. Dieses Material ist biokompatibel und hat einen Brechungsindex nahe dem von Glas. Darüber hinaus weist es eine sehr geringe Gasdurchl?ssigkeit auf, was eine pr?zise Steuerung der Gaskonzentration innerhalb der Ger?te erm?glicht. Aufgrund dieser Eigenschaften sind die COP-Mikrofluidikger?te ideal für die Nachbildung der Darmumgebung. Au?erdem erm?glichen sie eine genaue Sauerstoffkontrolle.
Auf der Grundlage dieser Daten wollten wir eine physiologisch relevante anaerobe Darmumgebung in der Be-Doubleflow-Vorrichtung schaffen. Um dies zu erreichen, haben wir den Sauerstoffgehalt im Kulturmedium vor dem Eintritt und nach dem Austritt aus dem mikrofluidischen Kanal gemessen. Der Kanal enthielt eine intestinale Epithelschicht mit unterschiedlichen Flussraten.

Mikrofluidische Vorrichtung

Der Be-Doubleflow-Chip (Abb. 1) besteht aus zwei Flüssigkeitskan?len, die durch eine por?se Membran getrennt sind und den Austausch von Substanzen und Faktoren zwischen den Zelltypen in beiden Kompartimenten erm?glichen. Darüber hinaus sind diese Kan?le mit Gewindeein- und -ausl?ssen versehen, die für den Anschluss an Perfusionssysteme vorgesehen sind und die Erneuerung des Kulturmediums gew?hrleisten. Folglich erzeugt das System Tangentialkr?fte, die das Verhalten der Zellen direkt beeinflussen. Diese tangentialen Kr?fte entstehen durch die Str?mung und die Geschwindigkeit des Kulturmediums, das sich durch die Kan?le bewegt, und werden als Scherkr?fte oder Scherspannung bezeichnet.

Mikrofluidischer Aufbau und Sauerstoffsensoren

Mikrofluidische Schaltungselemente

Eine Spritzenpumpe (Infusetek) führte das Kulturmedium in das Ger?t ein und sorgte für einen kontinuierlichen Fluss. W?hrend sich das Medium durch das System bewegt, übt es eine tangentiale mechanische Stimulation (Scherspannung) auf die Zelloberfl?che aus und liefert gleichzeitig wichtige N?hrstoffe und Gase. Darüber hinaus haben die verwendeten Schl?uche (FEP/Tygon) und andere Komponenten des Systems eine sehr geringe Gasdurchl?ssigkeit. So wurde sichergestellt, dass die Sensormesswerte den Sauerstoffgehalt in der Flüssigkeit ohne Verluste im Kreislauf wiedergeben.
Zur ?berwachung des Sauerstoffgehalts wurden sowohl am Einlass als auch am Auslass des Fluidiksystems Off-Chip-Sauerstoffsensoren (FTC-SU-PSt7-10-YOP-S) eingebaut. Zur Durchführung der Messungen wurde das Programm PreSens Measurement Studio 2 verwendet. Der PC ist mit dem OXY-4 ST Messger?t verbunden, das wiederum die optische Polymerfaser (POF-FTC-L2.5-1ST) mit dem Sauerstoffflusssensor im mikrofluidischen Kreislauf verbindet (Abb. 2).

Sauerstoffsensoren

Sauerstoff-Durchflusszellen (FTC-SU-PSt7-10-YOP-S) bieten die folgenden Vorteile:

• Sie dringen nicht in den Fluidikkanal für die Zellkultur ein. Sie erm?glichen daher einen einfachen Anschluss an externe Schl?uche. Darüber hinaus ist dieses Design sowohl mit flexiblen als auch mit halbstarren Schl?uchen kompatibel.
• Da sie steril und einwegf?hig sind, ist kein Reinigungsprotokoll erforderlich.
• Sie erm?glichen die Gaskontrolle sowohl im oberen (epithelialen) als auch im unteren (endothelialen) Kanal.
• Darüber hinaus erm?glichen sie die Sauerstoffmessung sowohl am Einlass als auch am Auslass des Kanals, was eine Echtzeitüberwachung des zellul?ren Sauerstoffverbrauchs erm?glicht.

Vor dem Einsatz der Sensoren im System testeten wir eine Natriumsulfitl?sung (sauerstofffrei), um Messwerte von 0 % sicherzustellen (Abb. 3).

Kontrolle der Kulturbedingungen für eine anaerobe Mikroumgebung

Zellkultur im Be-Doubleflow

Wir verwendeten Epithelzellen der immortalisierten kommerziellen Caco-2-Zelllinie in einem Co-Kultur-Verh?ltnis, das die Bedingungen im Dünndarm simuliert, mit HT29MTX-Zellen (modifiziert für die Schleimproduktion) im Kanal des Be-Doubleflow-Ger?ts (Abb. 1). Zun?chst injizierten wir eine Kollagenbeschichtung in PBS (0,1 mg/mL) in den Kanal und inkubierten ihn 2 Stunden lang bei 37 °C. Vor der Aussaat wurde die Beschichtungsl?sung durch vollst?ndiges Entleeren des Kanals vorsichtig entfernt. Anschlie?end wurde eine Suspension von einer Million Caco-2 + HT29MTX-Zellen (9:1) in 40 ?l hochglukosehaltigem DMEM-Kulturmedium, das mit 10 % f?talem Rinderserum und 1 % nicht-essentiellen Aminos?uren erg?nzt wurde, in den Mikrofluidikkanal eingebracht. Nach 4 Stunden statischer Inkubation bei 37 °C und 5 % CO? wurden weitere 300 ?l N?hrmedium zugegeben, um die N?hrmediumreservoirs zu füllen. 24 Stunden lang wurde das Ger?t dann (bei 37 °C und 5 % CO?) auf einer Wippe bebrütet, so dass das N?hrmedium durch die Schwerkraft automatisch erneuert wurde. Dieser sanfte Fluss erm?glicht die Bildung einer lebensf?higen zellul?ren Monoschicht. Nachdem wir die Bildung der zellul?ren Monoschicht mit Hilfe der optischen Mikroskopie best?tigt hatten, bauten wir das Ger?t an eine Spritzenpumpe mit Anschlüssen, Schl?uchen und Sauerstoffsensoren an. Schlie?lich lie?en wir das Kulturmedium mit den zuvor festgelegten Durchflussraten durch das geschlossene System flie?en. Wir haben alle 5 Minuten eine Sauerstoffmessung programmiert.

Mediumfluss und Scherspannung

Um die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium zu charakterisieren und die Flussrate entsprechend dem Sauerstoffverbrauch anzupassen, haben wir Be-Doubleflow mit verschiedenen Scherkr?ften beaufschlagt. In der Literatur wird berichtet, dass die auf das Darmepithel ausgeübten Scherkr?fte zwischen 0,002 und 0,08 dyn/cm? liegen, wobei 0,02 dyn/cm? der von Forschern am h?ufigsten verwendete Wert ist. [6] Zu diesem Zweck haben wir die Formel 1 angewandt, in der die Durchflussrate oder -geschwindigkeit, die einer bestimmten Scherspannung in einem rechteckigen Kanal entspricht, unter Berücksichtigung der H?he, der Breite und der Viskosit?t der Flüssigkeit berechnet wird.

Die Durchflussraten für 0,02 dyn/cm? und 0,01 dyn/cm? betragen also 5,6 bzw. 2,9 ?L/min.

Sauerstoffverbrauch im Vergleich zur Durchflussrate

Die ersten Ergebnisse zeigten, dass nach 24 Stunden Kultur unter Flussbedingungen der Sauerstoffgehalt am Kanalausgang von anf?nglichen Werten von 18-20 % auf 12-14 % bei 0,02 dyn/cm? sank. Andererseits sank der Sauerstoffgehalt bei 0,01 dyn/cm? nach 12 Stunden Perfusion auf 6 % (Abb. 4).

In Anbetracht der ersten Ergebnisse zeigte die Scherbelastung von 0,01 dyn/cm? Sauerstoffwerte, die n?her an der anaeroben Darmumgebung für das Lumen und die Schleimhaut lagen (4,1-4,8 %). Daher behielten wir diese Bedingung drei Tage lang bei, um das Fortschreiten des Sauerstoffverbrauchs zu bewerten.
Abbildung 5 zeigt die ersten 8-12 Stunden, in denen der O?-Anteil drastisch abnimmt, bevor er sich bei Werten zwischen 5 und 8 % stabilisiert.

Bei der Analyse der Werte über die Zeitintervalle stellten wir fest, dass der durchschnittliche Sauerstoffgehalt am Ger?teausgang zwischen 8 und 24 Stunden bei 6,06 % lag. Im n?chsten 24-Stunden-Zeitraum (24-48 Stunden) sank der Durchschnittswert leicht auf 5,97 %. Im letzten Zeitraum (48-72 Stunden) schlie?lich erreichte der durchschnittliche Sauerstoffgehalt 5,74 %.
Daraus l?sst sich schlie?en, dass sich der Sauerstoffgehalt ab 8 Stunden nach Beginn der Kultur zwischen 5-6 % stabilisiert, w?hrend die N?hrstoffe kontinuierlich erneuert werden. Dieser Aufbau erm?glicht die Schaffung einer anaeroben Darmumgebung, die die physiologischen Bedingungen im Be-Doubleflow genau nachahmt.

Integrit?t des Epithels und strukturelle Reifung

Die epitheliale Monolage blieb nach drei Tagen unter 0,01 dyn/cm? intakt (Abb. 6). Darüber hinaus wurde eine Zunahme der H?he sowie die Bildung von dreidimensionalen Strukturen wie Kuppeln und Pseudovilli beobachtet, was auf eine epitheliale Reifung und Differenzierung hinweist.

Zusammenfassend l?sst sich sagen, dass die Durchflussrate des Kulturmediums einen erheblichen Einfluss auf die Sauerstoffkonzentration hat, die von der Caco2+HT29MTX (9:1) Co-Kultur verbraucht wird. Eine Flussrate von 5,6 ?L/min (0,02 dyn/cm?) führt zu einem Sauerstoffverbrauch von 6-10 % (im Vergleich zur Eingangskonzentration), was au?erhalb der in der Literatur angegebenen Sauerstoffwerte liegt. Dies deutet darauf hin, dass h?here Flussraten m?glicherweise nicht den typischen Sauerstoffverbrauch im Dünndarm widerspiegeln. Andererseits führt eine Flussrate von 2,9 ?L/min (0,01 dyn/cm?) zu einem Sauerstoffverbrauch von 14-15 %. Dieser wiederum liegt im Durchschnitt bei 6 % Sauerstoff und entspricht damit genau den für den Dünndarm berichteten Werten. Niedrigere Durchflussraten simulieren also die physiologischen Bedingungen genauer. Daher bietet das mikrofluidische Be-Doubleflow-Ger?t in Kombination mit den Sauerstoffsensoren von Presens eine effektive Plattform für die Untersuchung des Sauerstoffgehalts und die Schaffung einer anaeroben Darmumgebung in vitro.

Referenzen

[1] Ashammakhi, N. et al. Gut-on-a-chip: Current progress and future opportunities. Biomaterials 255, (2020).
[2] Jalili-Firoozinezhad, S. et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat. Biomed. Eng. 3, 520–531 (2019).
[3] Kim, D. & Herr, A. E. Protein immobilization techniques for microfluidic assays. Biomicrofluidics 7, 1–47 (2013).
[4] Nam, G. et al. Water permeable flow of polydimethylsiloxane controlled by physicochemical treatment. JMST Adv. 1, 41–47 (2019).
[5] Keeley, T. P. & Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiol. Rev. 99, 161–234 (2019).
[6] Chi, M. et al. A microfluidic cell culture device (μFCCD) to culture epithelial cells with physiological and morphological properties that mimic those of the human intestine. Biomed. Microdevices 17, 1–10 (2015).
[7] Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. bioRxiv 2020.08.25.266221 (2020) doi:10.1101/2020.08.25.266221.

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