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Adh?sives Zellwachstum und Mikroskopie auf O2 und pH Sensorfolien
Einfluss von Beschichtung auf die Zelladh?sion an VisiSens? Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R
C. Schmittlein1, R. J. Meier2, G. Liebsch2, J. Wegener1,3
1Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universit?t Regensburg, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
3Fraunhofer-Einrichtung für Mikrosysteme und Festk?rper-Technologien (EMFT), Regensburg, Deutschland
Suspensionen von Madin-Darby Canine Kidney-Zellen (MDCK-II) wurden auf VisiSens? Sensorfolien SF-RPSu4 (O2) und SF-HP5R (pH) plattiert, die in regul?ren Petrischalen integriert waren. Die Zelladh?sion auf einer regul?ren Petrischalen-Oberfl?che, unbeschichteten Sensorfolien und mit verschiedenen adh?sionsf?rdernden Substanzen beschichteten Sensorfolien wurde durch Anf?rben und mikroskopische Analyse bestimmt. Nachdem die Anfangsvorgaben festgelegt waren, wurden normale Ratten-Nierenzellen (NRK), Rinderaorta-Endothelzellen (BAEC) und humane Glioblastomzellen (U-373 MG) in diese Studie eingeschlossen. Wir haben festgestellt, dass die Sensorfolien keinen toxischen Effekt auf die verschiedenen Zelllinien haben und dass die Zellen auf den Sensorfolien gut wachsen, mit keinem signifikanten Unterschied zu regul?ren Zellkultursubstraten.
Das Züchten von Tierzellen direkt auf der Oberfl?che einer O2 oder pH Sensorfolie in Kombination mit Fluoreszenzimaging macht es m?glich, die Konzentration der beiden Analyten in der direkten Mirkoumgebung der anhaftenden Zellen zu quantifizieren, anstatt deren Konzentration mit einem zellfreien Sensor in einiger Entfernung in der Masse zu messen. Der geringe Abstand zwischen Sensorfolie und Zelle von nur 50 bis 200 nm erm?glicht lokale Messungen der Sauerstoffkonzentration und des pH-Wertes an der Zelloberfl?che mit hoher zeitlicher und r?umlicher Aufl?sung. Dadurch l?sst sich die inh?rente Latenzzeit integrierender Sensoren vermeiden, die mehrere Zelldurchmesser entfernt platziert werden, was oft sehr positionsabh?ngig ist und zus?tzlich durch eine komplexere Diffusion und Konvektion des Analyten beeinflusst wird. Diese Studie befasst sich mit den Auswirkungen einer Sensorbeschichtung mit adh?sionsf?rdernden Substanzen und die nachfolgende Sensorleistung.
Material & Methoden
MDCK-II und NRK-Zellen (Leibniz-Institut DSMZ, Deutschlang), BAEC (zur Verfügung gestellt von Dr. Zink und Prof. R?sen vom Diabetes-Forschungsinstitut Düsseldorf, Deutschland) und U-373 MG Zellen (zur Verfügung gestellt von Prof. Buschauer, Institut für Pharmazie, Universit?t Regensburg, Deutschland) wurden in subkonfluenter (5,0 x 104 Zellen cm-2) und konfluenter (4,5 x 105 Zellen cm-2) Zelldichte auf den Sensorfolien ausplattiert.
Die bildgebenden Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R (PreSens) wurden als Zellkultursubstrat verwendet. Die SF-RPSu4 Sensorfolien bestehen aus einer r?tlichen, sauerstoffempfindlichen Schicht auf einer transparenten Tr?gerfolie, und einer wei?en optischen Isolierschicht (OIW), die leicht durch Abziehen entfernt werden kann (Abb. 1). Die sauerstoffempfindliche Schicht hat andere Oberfl?cheneigenschaften als die optische Isolierschicht, so dass sowohl Sensoren mit als auch ohne OIW als Zellsubstrat getestet wurden. pH Sensorfolien werden mit einer nicht entfernbaren OIW-Schicht geliefert, so dass hier nur ein Folientyp (mit OIW) getestet wurde. Die Sensorfolien wurden mit einem biokompatiblen Silikonkleber (SG-1) am Boden von Standard-Petrischalen mit 3,5 cm Durchmesser (Saerstedt) angebracht. Die funktionalisierten Schalen wurden 1 Minute lang violettem Ar-Plasma ausgesetzt, um sie vor der Verwendung zu reinigen und zu sterilisieren. F?tales K?lberserum (FCS), Fibronektin, Gelatine und Poly-L-Lysin wurden als adh?sionsf?rdernde Beschichtungen verwendet und wie in Tabelle 1 aufgelistet auf die Sensorfolien aufgebracht.
24 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die Zellen auf O2 Sensorfolien mit einer Lebendf?rbung behandelt, die aus 2 ?M Calcein-AM (Invitrogen, Ex 488 nm, Em 530 nm) und 4 ?M Ethidium-Homo-Dimer (Biotrend Chemikalien, Ex 528 nm, Em 617 nm) in PBS++ (37 °C, 30 Min.) bestand. Da die Eigenschaften der pH Sensorfolien diese Art der Lebend/Tot-F?rbung st?ren würden, wurden die Zellen auf pH Sensorfolien mit TRITC-Phalloidin (Invitrogen, Ex 515 nm, Em 650 nm) gef?rbt, um die Architektur des Actin-Zytoskeletts zu dokumentieren. Da beide Sensorfolien nicht transparent sind, wurden die Zellen mittels eines aufrecht stehenden konfokalen Laserscan-Mikroskops (Nikon Eclipse 90i) bei zehnfacher Vergr??erung visualisiert.
Zelladh?sion auf O2 Sensorfolien SF-RPSu4-OIW
O2 Sensorfolien mit optischer Isolierschicht (SF-RPSu4-OIW) wurden mit verschiedenen adh?sionsf?rdernden Substanzen (siehe Tab. 1) beschichtet, um den individuellen Einfluss der Beschichtung auf die Zelladh?sion zu untersuchen. Zelladh?sion auf unbeschichteten Sensorfolien (roter Kasten in Abb. 2) und Standardzellkultur-Petrischalen wurden als Referenz verwendet. Abbildung 2A zeigt subkonfluente MDCK-II Zellen nach Leben/Tot-F?rbung durch CAM/EtHD. Die grüne zytoplasmatische Fluoreszenz von CAM zeigt lebende Zellen auf allen Substraten, mit nur wenigen rot fluoreszierenden Kernen toter Zellen. Auf sowohl beschichteten als auch unbeschichteten Sensorfolien zeigt jedoch ein Teil der Zellen nur eine schwache Adh?sion an das Substrat und nimmt eine abgerundete Morphologie an. Die Anzahl der voll ausgebreiteten Zellen ist bei behandelten und unbehandelten Sensorfolien im Vergleich zu Kontrollbedingungnen niedriger. Die Anzahl der durch die rote Kernemission von EtHD markierten toten Zellen ist nicht erh?ht, wenn Zellen auf Sensorfolien kultiviert werden, was darauf hinweist, dass die Folien nicht toxisch sondern nur weniger adh?siv sind.
In Abbildung 2B gruppierte mikroskopische Aufnahmen zeigen die Ergebnisse, wenn sich 24 Stunden nach dem Ausplattieren vollst?ndige Zellschichten gebildet haben. Die Lebendf?rbung von Zellen, die auf unbeschichteten, mit Fibronektin und Gelatine beschichteten Sensorfolien kultiviert wurden, zeigt lebende Zellen und eine ?hnliche Zellabdeckung wie bei der Kontrolle. die Anzahl der toten Zellen auf nicht beschichteten Folien ist jedoch im Vergleich zu den Referenz- und den beschichteten Sensorfolien um etwa 50 % erh?ht. Darüber hinaus fehlt den unbeschichteten Sensorfolien eine konfluente Zellschicht, die sich im Gegensatz zu den beschichteten Folien noch nicht vollst?ndig gebildet hat.
Zelladh?sion auf O2 Sensorfolien SF-RPSu4 ohne OIW
MDCK-II Zellen k?nnen direkt auf der Oberfl?che der sauerstoffempfindlichen Schicht der Sensorfolie kultiviert werden, wie in Abbildung 3 gezeigt ist. Die Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrolle, beschichteten und unbeschichteten Sensorfolien. Die zus?tzliche Beschichtung bewirkte weder eine verbesserte Adh?sion noch gab es eine signifikant unterschiedliche Anzahl an toten Zellen auf einem der Substrate, insbesondere wenn die Zellen bis zur Konfluenz wachsen konnten.
Zus?tzlich wurden drei weitere Zelllinien analysiert. Mikroskopische Aufnahmen von BAEC, NRK und U-373 Zellen, die CAM und EtHD ausgesetzt waren, sind in Abbildung 4 zusammengestellt. ?hnlich den Ergebnissen, die für MDCK-II Zellen erhalten wurden, haften die anderen Zelllinien auch auf nicht beschichteten Sauerstoffsensorfolien ohne die optische Isolierschicht und breiten sich darauf aus. Es bestand kein signifikanter Unterschied in der Zelladh?sion im Vergleich zu Standardzellkulturschalen, wenn die Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet wurden. Bei der Kultivierung von Zellen auf beschichteten oder unbeschichteten Sauerstoffsensorfolien wurde jedoch ein geringfügiger Anstieg der Anzahl an toten, abgerundeten Zellen beobachtet. Dementsprechend bring die Beschichtung von Sensorfolien mit haftungsf?rdernden Materialien keine wesentliche Verbesserung der Adh?sion oder der Lebensf?higkeit der untersuchten Zellen.
Zelladh?sion auf pH Sensorfolien SF-HP5R
Die pH Sensorfolien SF-HP5R wurden auch als Kultursubstrat mit oder ohne die haftungsf?rdernden Beschichtungen getestet, die zuvor für die O2 Sensorfolien verwendet wurden. Die Zellen wurden erneut als subkonfluente oder konfluente Zellmonolayer untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass Zellen an der Oberfl?che hafteten und ein Actin-Zytoskelett, mit charakteristischen Merkmalen wie dem sehr prominenten Actingürtel, ausbildeten. Es lie? sich kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle, beschichteten und unbeschichteten Sensorfolien feststellen. Daher k?nnen pH Sensorfolien ohne vorherige Beschichtung mit adh?sionsf?rdernden Materialien verwendet werden.
Zusammenfassung
Die Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R wurden allgemein auf ihre Biokompatibilit?t und insbesondere auf die F?higkeit Zelladh?sion zu f?rdern getestet. Wenn die üblichen SF-RPSu4 Sauerstoffsensorfolien mit OIW als Kultursubstrat verwendet werden, empfehlen wir die Beschichtung der Sensorfolien mit adh?sionsf?rdernden Substraten wie Gelatine oder Fibronektin, um das Anhaften und Verteilen der Zellen auf der Sensorfolie zu erleichtern. Wenn die OIW von der sauerstoffempfindlichen Schicht der SF-RPSu4 entfernt wird, ist eine Beschichtung nicht zwingend erforderlich, wie in Experimenten mit MDCK-II, NRK, BAEC oder U-373 Zellen gezeigt wurde. Die pH Sensorfolien SF-HP5R erm?glichen MDCK-II Zellen sich anzuhaften und zu verteilen. Da sich andere Zelllinien, als die in dieser Studie verwendeten, unterschiedlich anhaften und ausbreiten k?nnen, empfehlen wir die Verwendung von Serum, serumhaltigem Kulturmedium oder Proteinen wie Fibronektin oder Poly-L-Lysin zur Beschichtung für bessere Adh?sion.