3D-Kulturen von Bandscheiben-Chondrocyten

Optosensorische Online-?berwachung der Sauerstoff- und pH-Kinetik

Hydrogel-basierte 3D-Zellkultursysteme bieten entscheidende Vorteile im Tissue Engineering für zellbasierte Therapie von Bandscheibendegeneration. Eine lichtmikroskopische Kontrolle sowohl der Kulturqualit?t als auch der morphologischen Differenzierung ist jedoch innerhalb dieser dichten Matrix nicht m?glich. Für eine Beurteilung der Qualit?t müssen alternative Parameter berücksichtigt werden. In der vorliegenden Studie wurde die Verfügbarkeit von Sauerstoff im Kulturmedium und die Kinetik des pH-Wertes unter Verwendung des SDR analysiert. Beide Parameter sind Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche und zuverl?ssige in vitro Kultivierung und Differenzierung.

Die autologe Chondrozytentransplantation ist eine moderne experimentelle Therapie zur Behandlung degenerativer Bandscheibenerkrankungen. Auch eine Reparatur von Bandscheibensch?digungen durch transplantierte Chondrozyten scheint in naher Zukunft m?glich. Man muss jedoch berücksichtigen, dass unter in vivo Bedingungen die Sauerstoffkonzentration innerhalb des Bandscheibenkerns sehr niedrig ist. Da Chondrozyten an diese Situation gew?hnt sind, k?nnte der Transfer in eine normoxische Kulturumgebung sch?dlich sein. Sensible Prozesse der in vitro Zellproliferation und -differenzierung k?nnen routinem??ig nur durch strikte Einhaltung definierter Kulturparameter erreicht werden. Chondrozyten wachsen in einer Gelmatrix besser als in Monolayerkultur, weil die r?umliche Umgebung der Situation innerhalb der Bandscheibe besser ?hnelt (Abb. 1). Genaue Messungen des Sauerstoffverbrauchs w?hrend der Kultivierung erlauben Rückschlüsse auf den physiologischen Status und die Qualit?t der Kulturbedingungen. Beide Kulturparameter konnten bisher nicht kontinuierlich überwacht werden - haupts?chlich, weil die erforderliche miniaturisierte Technik fehlte. Das optosensorische Messsystem SDR von PreSens erm?glicht nun die nicht-invasive Detektion beider Kulturparameter nahe der Zellen.

Die Charakterisierung der Kinetik von gel?stem Sauerstoff und pH-Wert wurde mit einer gut etablierten 3D-Kulturmethode durchgeführt. Drei definierte Zelldichten von 0,1, 0,5 und 1 · 10⁶ Zellen/ml wurden auf einer propriet?ren Hydrogelmatrix für etwa zwei Wochen in OxoDishes? bzw. HydroDishes? kultiviert. Jede Vertiefung enthielt 2 ml gepuffertes Kulturmedium mit pH 7,4. W?hrend der Studie wurde das Medium dreimal - an den Tagen 2, 5 und 8 - in den Proben mit Zellen sowie in den Kontrollen gewechselt. Das Online-Monitoring begann kurz nach dem Auss?en der Zellen. Optische Kontrollen wurden an den Tagen 6 und 9 durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Multiplatten kurz aus der Standard-Inkubatoratmosph?re von 5 % CO₂ / 95 % relativer Feuchtigkeit entfernt. Sauerstoffkinetiken wurden erstellt, indem der Durchschnitt von drei Replikaten pro Zelldichte berechnet wurde. Zellfreie Kulturen dienten als Kontrolle.

Proben mit h?chster Dichte zeigten den h?chsten Sauerstoffverbrauch und damit den niedrigsten Gehalt an gel?stem Sauerstoff (DO) im Kulturmedium (Abb. 2). Bei mittlerem Austausch stieg der DO wieder auf einen Wert, der ?hnlich dem Ausgangsniveau von 14 bis 16 % Sauerstoff war, entsprechend der vorhergehenden ?quilibrierung des Mediums. Je nach Stoffwechselaktivit?t der Probe sank der Sauerstoffgehalt innerhalb kurzer Zeit wieder auf ein neues Minimum. Nach Erreichen eines Minimalpunktes nahm das Niveau an gel?stem Sauerstoff in allen Proben wieder zu. Der Grund dafür ist vermutlich eine starke Reduktion der Stoffwechselaktivit?t, da Chondrozyten den Crabtree-Effekt nutzen. Die Sauerstoffkinetik wurde durch weitere komplexe Faktoren bestimmt: Ein Faktor, der diesem Effekt Rechnung tr?gt, ist die Zellproliferation. Innerhalb der Probe mit 0,5 x 10⁶ Zellen/ml war bereits nach dem zweiten Mediumwechsel eine ausgepr?gtere Abnahme der Sauerstoffkinetik im Vergleich zur h?chsten initialen Zelldichte zu erkennen, was auf eine h?here metabolische Aktivit?t hinwies. Ein weiterer Anstieg der Zelldichten führte daher zu einer verringerten Stoffwechselaktivit?t. Wie die Sauerstoffmessungen zeigten auch die pH-Kinetik eine charakteristische Dynamik entsprechend der Kultivierungsdauer und der initialen Zelldichte (Abb. 3). Die Kontrollen zeigten neben Ver?nderungen des Kulturmediums und Effekte durch ?ffnen der Inkubatortür einen weitgehend stabilen pH-Wert. Die pH-Werte der Proben mit Zellen sanken schon früher ab, ohne jedoch Werte von pH 7,0 zu unterschreiten (vgl. oben Crabtree-Effekt). Bei den h?heren Anfangszelldichten von 1,0 × 10⁶ und 0,5 × 10⁶ Zellen/ml dauert es nur etwa einen Tag, um das jeweilige pH-Minimum zu erreichen. Durch den Wechsel des Kulturmediums fand sowohl in Proben mit Zellen als auch in den zellfreien Kontrollen eine kurze pH-Verschiebung über den physiologisch optimalen Ausgangs-pH-Wert hinaus statt. Medien, die nicht in CO₂-Atmosph?re vorinkubiert worden waren, zeigten als Folge erh?hte pH-Werte, bis sie wieder mit der Inkubatoratmosph?re ?quilibriert waren. Diese ?quilibrierung konnte bis zu einem Tag dauern, da der Gasaustausch nur über passive Diffusion stattfand. Ein ?hnlicher Effekt wurde auch beim ?ffnen der Inkubatortür festgestellt: Bereits bei kurzem ?ffnen trat CO₂ nahezu vollst?ndig aus der Inkubatoratmosph?re aus. Folglich erh?hte sich der pH-Wert des Kulturmediums. Die überlagernden Effekte des steilen pH-Anstiegs und -Abfalls nach dem Kulturmediemwechsel und der metabolisch bedingte Abw?rtstrend behinderten eine genaue Interpretation der beobachteten pH-Kinetik. In Analogie zur Sauerstoffmessung deutete ein weniger ausgepr?gter Abw?rtstrend auf einen durch Substratmangel reduzierten Stoffwechsel hin. Durch kontinuierlichen pH-Nachweis konnte jedoch vermieden werden, dass der pH-Wert aufgrund einer gesteigerten metabolischen Aktivit?t auf ungünstig niedrige Werte absank. Letzteres h?tte die zellul?re Aktivit?t hemmen oder sogar Zellsch?den verursachen k?nnen. Die Online-?berwachung des pH-Werts lieferte somit wertvolle Hinweise, wann ein Kulturmedienwechsel n?tig war.

Zellkulturkontrolle

Die nicht-invasive ?berwachung von DO und pH mit dem SDR eignet sich gut für In-Process-Bewertungen der Kulturqualit?t und zur Bestimmung des optimalen Zeitpunkts für den Medienwechsel in 3D-Zellkulturen. Es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung des hier beschriebenen Kultursystems die Qualit?t autologer Chondrozyten für die Transplantation verbessert. Durch DO-Kinetik k?nnen Standardprotokolle für eine noch effizientere Kultivierung von Chondrozyten abgeleitet und der optimale Zeitpunkt für die Chondrozytenernte bestimmt werden. Darüber hinaus erm?glicht das SDR durch den Nachweis von verfügbarem Sauerstoff erstmals einen pr?zisen Einblick in 3D-Zellkulturen. Pr?zise Messungen und der Vorteil der kontinuierlichen Datenerfassung unterstreichen das hohe Potential und den Vorteil für zukünftige Anwendungen dieses Systems im Tissue Engineering. Neben der ?berwachung der metabolischen Substratversauerung ist das pH-Messsystem auch ein au?ergew?hnliches Instrument zum Schutz und zur Kontrolle von Pufferparametern in einem bestimmten Kulturmedium. Mit einer solchen Instrumentierung k?nnen Unternehmen die Qualit?t von Zell- und Tissueprodukten verbessern und ihren therapeutischen Nutzen für Patienten schneller erzielen.

Applikationsbericht nach
BioProcess International, 12/2008, 54 - 59.